NOR/398L0073.00T OJ L 305/98, p. 1-181 Commission Directive 98/73/EC of 18 September 1998 adapting to technical progress for the 24th time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of the laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances KOMMISJONSDIREKTIV 98/73/EF av 18. september 1998 om 24. tilpasning til den tekniske utvikling av rådsdirektiv 67/548/EØF om tilnærming av lover og forskrifter om klassifisering, emballering og merking av farlige stoffer KOMMISJONEN FOR DE EUROPEISKE FELLESSKAP HAR - under henvisning til traktaten om opprettelse av Det europeiske fellesskap, under henvisning til rådsdirektiv 67/548/EØF av 27. juni 1967 om tilnærming av lover og forskrifter om klassifisering, emballering og merking av farlige stoffer(1), sist endret ved kommisjonsdirektiv 97/69/EF(2), særlig artikkel 28, og ut fra følgende betraktninger: Vedlegg I til direktiv 67/548/EØF inneholder en liste over farlige stoffer og nærmere opplysninger om klassifisering og merking av hvert stoff. Nåværende vitenskapelig og teknisk kunnskap har vist at listen over farlige stoffer i nevnte vedlegg bør tilpasses og suppleres. Vedlegg V til direktiv 67/548/EØF fastsetter metoder for bestemmelse av stoffers og stoffblandingers fysisk-kjemiske egenskaper, toksisitet og økotoksisitet. Det er nødvendig å tilpasse nevnte vedlegg til den tekniske utvikling. Tiltakene fastsatt i dette direktiv er i samsvar med uttalelse fra Komiteen for tilpasning til den tekniske utvikling av direktiver om fjerning av tekniske handelshindringer på området farlige stoffer og stoffblandinger - VEDTATT DETTE DIREKTIV: Artikkel 1 I direktiv 67/548/EØF gjøres følgende endringer: 1) I vedlegg I gjøres følgende endringer: a) Postene i vedlegg I til dette direktiv erstatter de tilsvarende postene i vedlegg I til direktiv 67/548/EØF. b) Postene i vedlegg II til dette direktiv innsettes i vedlegg I til direktiv 67/548/EØF. 2) I vedlegg V gjøres følgende endringer: a) Vedlegg III A, III B og III C til dette direktiv tilføyes til del A i vedlegg V til direktiv 67/548/EØF. b) Vedlegg III D til dette direktiv tilføyes til del C i vedlegg V til direktiv 67/548/EØF. Artikkel 2 Medlemsstatene skal innen 31. oktober 1999 sette i kraft de lover og forskrifter som er nødvendige for å etterkomme dette direktiv. De skal umiddelbart underrette Kommisjonen om dette. Disse bestemmelsene skal, når de vedtas av medlemsstatene, inneholde en henvisning til dette direktiv, eller det skal vises til direktivet når de kunngjøres. Nærmere regler for henvisningen fastsettes av medlemsstatene. Artikkel 3 Dette direktiv trer i kraft den 20. dag etter at det er kunngjort i De Europeiske Fellesskaps Tidende. Artikkel 4 Dette direktiv er rettet til medlemsstatene. Utferdiget i Brussel, 18. september 1998. For Kommisjonen Ritt BJERREGAARD Medlem av Kommisjonen [Vedlegg I - II er offentliggjort i EFT L 305 av 16.11.1998, s. 3-142] VEDLEGG III A A.18. BESTEMMELSE AV POLYMERERS TALLMESSIG GJENNOMSNITTLIGE MOLEKYLMASSE OG MOLEKYLMASSEFORDELING 1. METODE Denne metoden for gelpermeasjonskromatografi er en gjengivelse av OECD TG 118 (1996). Grunnprinsipper og ytterligere tekniske opplysninger finnes i henvisning 1. 1.1. Innledning Siden polymerer har så forskjellige egenskaper, er det umulig å beskrive én enkelt metode som nøyaktig angir vilkårene for separasjon og evaluering som dekker alle muligheter og særegenheter ved separasjon av polymerer. Særlig er komplekse polymersystemer ofte uegnet til gelpermeasjonskromatografi (GPC). Dersom GPC ikke kan anvendes, kan molekylmassen bestemmes ved andre metoder (se vedlegget). I slike tilfeller skal det gis fullstendig begrunnelse for og beskrivelse av metoden som benyttes. Metoden som er beskrevet, bygger på DIN-standard 55672 (1). Detaljerte opplysninger om utførelse av forsøk og evaluering av data finnes i denne DIN-standarden. Dersom endringer i forsøksvilkårene er nødvendige, må disse endringene begrunnes. Andre standarder kan benyttes, forutsatt at det gis fullstendige henvisninger. Metoden som er beskrevet, bruker polystyrenprøver med kjent polydispersitet til kalibrering, og det er mulig at den må tilpasses for å være egnet for enkelte polymerer, for eksempel vannløselige og langkjedede, forgrenede polymerer. 1.2. Definisjoner og enheter Tallmessig gjennomsnittlig molekylmasse Mn og vektmessig gjennomsnittlig molekylmasse Mw bestemmes etter følgende ligninger: der Hi er detektorsignalets høyde fra grunnlinjen for retensjonsvolumet Vi, Mi er molekylmassen til polymerfraksjonen ved retensjonsvolumet Vi, og n er antallet datapunkter. Bredden til fordelingen av molekylmassen, som er et mål på systemets dispersitet, er gitt ved forholdet Mw/Mn. 1.3. Referansestoffer Siden GPC er en relativ metode, må kalibrering foretas. Til dette benyttes vanligvis lineært oppbygde polystyrenstandarder med kjente gjennomsnittlige molekylmasser Mn og Mw og kjent, snever molekylmassefordeling. Kalibreringskurven kan brukes til bestemmelse av molekylmassen til den ukjente prøven bare dersom det er valgt identiske vilkår for separasjon av prøven og standarden. Den sammenheng mellom molekylmassen og elueringsvolumet som bestemmes, er gyldig bare for de bestemte vilkårene ved det bestemte forsøket. Vilkårene omfatter først og fremst temperatur, løsemiddel (eller blanding av løsemidler), kromatografivilkår og separasjonskolonne eller -kolonnesystem. Molekylmassene til prøven som bestemmes på denne måten, er relative verdier og betegnes som "polystyrenekvivalente molekylmasser". Det betyr at molekylmassene kan avvike mer eller mindre fra absoluttverdiene, avhengig av strukturelle og kjemiske forskjeller mellom prøven og standarden. Dersom andre standarder benyttes, for eksempel polyetylenglykol, polyetylenoksid, polymetylmetakrylat eller polyakrylsyre, skal det begrunnes. 1.4 Prinsipp for prøvingsmetoden Både molekylmassefordelingen til prøven og gjennomsnittlige molekylmasser (Mn, Mw) kan bestemmes ved GPC. GPC er en spesiell type væskekromatografi der prøven separeres ut fra de enkelte bestanddelenes hydrodynamiske volumer (2). Separasjonen utføres idet prøven passerer gjennom en kolonne som er fylt med et porøst materiale, vanligvis en organisk gel. Små molekyler kan trenge gjennom porene, mens store molekyler holdes ute. De store molekylenes bane er dermed kortere, og disse kan elueres først. Mellomstore molekyler trenger gjennom noen av porene og elueres senere. De minste molekylene, med en gjennomsnittlig hydrodynamisk radius som er mindre enn gelens porer, kan trenge gjennom alle porene. Disse elueres til slutt. I en ideell situasjon styres separasjonen utelukkende av molekylstørrelsen, men i praksis er det vanskelig å unngå en viss absorpsjonsvirkning. Uensartet kolonnepakning og dødvolumer kan forverre vilkårene (2). Deteksjonen foretas for eksempel ved måling av brytningsindeks eller UV-absorpsjon og gir en enkel fordelingskurve. For at det skal oppnås faktiske molekylmasseverdier på kurven, må kolonnen kalibreres ved at polymerer med kjent molekylmasse og helst stort sett samme struktur, for eksempel forskjellige polystyrenstandarder, ledes gjennom den. Resultatet er vanligvis en Gauss-kurve, noen ganger trukket ut i en liten hale i enden med lav molekylmasse, der vertikalaksen viser mengden (vekt) til de forskjellige eluerte molekylmassefraksjoner, og horisontalaksen viser logaritmen til molekylmassen. 1.5. Kvalitetskriterier Repeterbarheten (relativt standardavvik) for elueringsvolumet bør være bedre enn 0,3 %. Nødvendig repeterbarhet for analysen sikres ved korrigering med intern standard dersom et kromatogram vurderes tidsavhengig og ikke oppfyller nevnte kriterium (1). Tallene for polydispersitet avhenger av standardenes molekylmasser. For polystyrenstandarder er følgende verdier typiske: Mp < 2 000 Mw/Mn < 1,20 2 000 ? Mp ? 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp er molekylmassen til standarden ved topphøyden.) 1.6 Beskrivelse av prøvingsmetoden 1.6.1. Tilberedning av standardløsninger av polystyren Polystyrenstandardene oppløses ved omhyggelig blanding i valgt elueringsmiddel. Ved tilberedning av løsninger skal det tas nøye hensyn til produsentens anbefalinger. Hvilke konsentrasjoner av standardene som velges, avhenger av forskjellige faktorer, for eksempel injeksjonsvolum, løsningens viskositet og analysedetektorens følsomhet. Det største injeksjonsvolumet må tilpasses til lengden av kolonnen, slik at overbelastning unngås. Typiske injeksjonsvolumer for analytisk separasjon med GPC med en kolonne på 30 cm ? 7,8 mm er vanligvis mellom 40 og 100 µl. Større volumer er mulig, men de bør ikke overstige 250 µl. Det optimale forholdet mellom injeksjonsvolumet og konsentrasjonen må bestemmes før den faktiske kalibreringen av kolonnen. 1.6.2. Tilberedning av prøveløsningen I prinsippet gjelder de ovennevnte krav også for tilberedning av prøveløsninger. Prøven oppløses i et egnet løsemiddel, for eksempel tetrahydrofuran (THF), ved omhyggelig risting. Den skal under ingen omstendighet oppløses i ultralydbad. Om nødvendig renses prøveløsningen gjennom et membranfilter med porestørrelse mellom 0,2 og 2 µm. Forekomst av uoppløste partikler skal registreres i den endelige prøvingsrapporten, siden disse kan skyldes fraksjoner med høy molekylmasse. Det benyttes en egnet metode til å bestemme vektprosenten av de oppløste partiklene. Løsningene brukes innen 24 timer. 1.6.3. Utstyr - løsemiddelbeholder, - gassutskiller (om nødvendig), - pumpe, - pulsdemper (om nødvendig), - injeksjonssystem, - kromatografikolonner, - detektor, - strømningsmåler (om nødvendig), - enhet for registrering og behandling av data, - avfallsbeholder. Det må sikres at GPC-systemet er inert med hensyn til de anvendte løsemidlene (for eksempel ved bruk av stålkapillærer for THF-løsemiddelet). 1.6.4. System for injeksjon og tilførsel av løsemiddel Et bestemt volum av prøveløsningen has i kolonnen med en automatisk prøveveksler eller manuelt i et nøye avgrenset område. For hurtig tilbaketrekking eller inntrykking av stempelet i injeksjonssprøyten kan føre til endringer i den observerte molekylmassefordelingen. Systemet for tilførsel av løsemiddel bør i størst mulig grad være vibrasjonsfritt, og bør helst inneholde en pulsdemper. Strømningshastigheten skal være omkring 1 ml/min. 1.6.5. Kolonne Avhengig av prøven karakteriseres polymeren ved hjelp av én enkelt kolonne eller flere seriekoplede kolonner. En rekke porøse kolonnematerialer med fastsatte egenskaper (for eksempel porestørrelse, ekslusjonsgrenser) er tilgjengelige i handelen. Valg av separasjonsgel eller kolonnelengde avhenger av både egenskapene til prøven (hydrodynamiske volumer, molekylmassefordeling) og de bestemte vilkårene for separasjon som løsemiddel, temperatur og strømningshastighet (1) (2) (3). 1.6.6. Teoretiske plater Kolonnen eller kolonnekombinasjonen som brukes til separasjonen, må karakteriseres ved antallet teoretiske plater. Dette innebærer, for THF som elueringsmiddel, at en løsning av etylbenzen eller et annet egnet ikke-polart oppløst stoff anbringes på en kolonne av kjent lengde. Antallet teoretiske plater er gitt ved følgende ligning: der N erantallet teoretiske plater, Ve er elueringsvolumet ved topphøyden, W er toppens bredde ved grunnlinjen, W1/2 er toppens bredde ved halv høyde. 1.6.7. Separasjonseffektivitet I tillegg til antallet teoretiske plater, som er en størrelse som bestemmer båndbredden, spiller også separasjonseffektiviteten en rolle, og den bestemmes av kalibreringskurvens stigning. Separasjonseffektiviteten til en kolonne er gitt ved følgende forhold: Ve,Mx - Ve,M(10Mx) / kolonnens tverrsnitt ?6,0 (cm3/cm2) der Ve,Mx er elueringsvolumet for polystyren med molekylmasse Mx, Ve,M(10Mx) er elueringsvolumet for polystyren med ti ganger større molekylmasse. Systemets løsningsevne defineres vanligvis som følger: R1,2 = 2 x (Ve1 - Ve2 / W1 + W2) ? (1 / log10(M2/M1)) der Ve1, Ve2 er elueringsvolumene til de to polystyrenstandardene ved topphøyden, W1, W2 er toppenes bredde ved grunnlinjen M1, M2 er molekylmassene ved topphøyde (vanligvis en forskjell på en faktor på 10). R-verdien for kolonnesystemet bør være større enn 1,7 (4). 1.6.8. Løsemidler Alle løsemidler må være av høy renhet (for THF benyttes en renhetsgrad på 99,5 %). Løsemiddelbeholderen (om nødvendig i nøytralgassatmosfære) må være tilstrekkelig stor til at kolonnen kan kalibreres og det kan analyseres flere prøver. Løsemiddelet må avgasses før det transporteres til kolonnen via pumpen. 1.6.9. Temperaturkontroll Temperaturen til de kritiske interne komponentene (injeksjonssløyfe, kolonner, detektor og rør og slanger) må være konstant og passe til valgt løsemiddel. 1.6.10. Detektor Formålet med detektoren er å registrere kvantitativt konsentrasjonen til prøven som elueres fra kolonnen. For å unngå unødvendig bredde på toppene må detektorcellens volum være så lite som mulig. Det må ikke være større enn 10 µl, unntatt for detektorer basert på lysspredning og viskositet. Til deteksjon brukes vanligvis differensialrefraktometri. Dersom særlige egenskaper ved prøve eller elueringsmiddel krever det, kan imidlertid andre typer detektorer benyttes, for eksempel UV/VIS-, IR- eller viskositetsdetektorer. 2. RESULTATER OG PRØVINGSRAPPORT 2.1. Resultater Det vises til DIN-standarden (1) når det gjelder mer detaljerte evalueringskriterier og krav i forbindelse med innsamling og behandling av data. For hver prøve utføres to uavhengige prøvinger. Resultatene analyseres hver for seg. Mn, Mw, Mw/Mn og Mp angis for hver måling. Det skal angis eksplisitt at de målte verdiene er relative verdier som tilsvarer den anvendte standardens molekylmasse. Etter bestemmelse av retensjonsvolumene eller retensjonstidene (eventuelt korrigert ved hjelp av en intern standard) settes log Mp-verdiene (der Mp er kalibreringsstandardens topphøyde) av mot en av disse størrelsene. Minst to kalibreringspunkter er nødvendige per molekylmassedekade, og minst fem målepunkter kreves for hele kurven, som bør dekke prøvens anslåtte molekylmasse. Kalibreringskurvens endepunkt for lav molekylmasse defineres ved n-heksylbenzen eller et annet egnet ikke-polart oppløst stoff. Antallsverdi og vektgjennomsnittsverdi for molekylmassen bestemmes vanligvis ved hjelp av et system for elektronisk databehandling, på grunnlag av formlene i nr. 1.2. For manuell beregning vises det til ASTM D 3536-91 (3). Fordelingskurven må framlegges i form av en tabell eller en figur (differensialfrekvens eller prosentsum mot log M). I den grafiske framstillingen bør en molekylmassedekade normalt svare til ca. 4 cm i bredde og topphøyden være ca. 8 cm. For integralfordelingskurver bør forskjellen mellom 0 og 100 % på ordinataksen være ca. 10 cm. 2.2. Prøvingsrapport Prøvingsrapporten skal omfatte følgende opplysninger: 2.2.1. Prøvingsstoffet - tilgjengelige opplysninger om prøvingsstoffet (art, tilsetningsstoffer, urenheter), - beskrivelse av behandlingen av prøven, observasjoner, problemer. 2.2.2. Apparatur - beholder til elueringsmiddel, inert gass, avgassing av elueringsmiddelet, sammensetning av elueringsmiddelet, urenheter, - pumpe, pulsdemper, injeksjonssystem, - separasjonskolonner (produsent, alle opplysninger om egenskapene til kolonnene, for eksempel porestørrelse og separasjonsmateriale, antall, lengde og rekkefølge av de anvendte kolonnene), - antall teoretiske plater i kolonnen (eller kolonnekombinasjonen), separasjonseffektivitet (systemets løsningsevne), - opplysninger om toppenes symmetri, - kolonnetemperatur, type temperaturkontroll, - detektor (måleprinsipp, type, kuvettevolum), - eventuell strømningsmåler (produsent, måleprinsipp), - system for registrering og behandling av data (maskinvare og programvare). 2.2.3. Kalibrering av systemet - detaljert beskrivelse av metoden som brukes til framstilling av kalibreringskurven, - opplysninger om kvalitetskriterier for denne metoden (for eksempel korrelasjonsfaktor, feilsum av kvadrater), - opplysninger om alle ekstrapoleringer, antakelser og tilnærminger gjort under forsøket og evaluering og behandling av data, - alle målinger som er brukt til framstilling av kalibreringskurven, må dokumenteres i en tabell som omfatter følgende opplysninger for hvert kalibreringspunkt: - prøvens navn, - prøvens produsent, - karakteristiske verdier av standardene Mp, Mn, Mw og Mw/Mn, som angitt av produsenten eller utledet ved etterfølgende målinger, sammen med opplysninger om bestemmelsesmetoden, - injeksjonsvolum og injeksjonskonsentrasjon, - Mp-verdi benyttet ved kalibreringen, - elueringsvolum eller korrigert retensjonstid målt ved topphøydene, - Mp beregnet ved topphøyden, - prosentvis feil for den beregnede Mp og kalibreringsverdien. 2.2.4. Evaluering - evaluering på tidsbasis: metoder benyttet for å sikre nødvendig reproduserbarhet (korrigeringsmetode, intern standard osv.) - opplysninger om hvorvidt evalueringen er foretatt på grunnlag av elueringsvolumet eller retensjonstiden, - opplysninger om begrensningene ved evalueringen dersom en topp ikke er fullstendig analysert, - beskrivelse av eventuelle utglattingsmetoder, - framgangsmåter for tilberedning og forbehandling av prøven, - angivelse av eventuelle uoppløste partikler, - injeksjonsvolum (µl) og injeksjonskonsentrasjon (mg/ml), - observasjoner som tyder på virkninger som fører til avvik fra den ideelle GPC-profilen, - detaljert beskrivelse av alle endringer i prøvingsmetodene, - nærmere opplysninger om feilintervaller, - eventuelle andre opplysninger og observasjoner som er relevante for tolkningen av resultatene. 3. HENVISNINGER (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. (2) Yau, W. W., Kirkland and Bly, D. D. (eds.) (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC), American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Vedlegg Eksempler på andre metoder for bestemmelse av antallsgjennomsnittsverdi av molekylmasse (Mn) for polymerer Gelpermeasjonskromatografi (GPC) er den foretrukne metode for bestemmelse av Mn, særlig dersom et sett med standarder med struktur som er sammenlignbar med polymerstrukturen, er tilgjengelig. Dersom det er praktiske vanskeligheter med å bruke GPC, eller dersom det allerede forventes at stoffet ikke kan oppfylle det fastsatte Mn-kriteriet (noe som må bekreftes), finnes det imidlertid alternative metoder, for eksempel: 1. Bruk av kolligative egenskaper 1.1. Ebullioskopi/kryoskopi innebærer måling av kokepunktforhøyelsen (ebullioskopi) eller frysepunktsenkning (kryoskopi) til et løsemiddel når polymeren tilsettes. Metoden bygger på at virkningen av den oppløste polymeren på koke-/frysepunktet til løsningen avhenger av molekylmassen til polymeren (1) (2). Anvendelsesområde: Mn < 20 000. 1.2. Senkning av damptrykk innebærer måling av damptrykket til en valgt referanseløsning før og etter tilsetning av kjente mengder polymerer (1) (2). Anvendelsesområde: Mn < 20 000 (teoretisk; i praksis av begrenset verdi). 1.3. Membranosmometri bygger på osmoseprinsippet, det vil si løsemiddelmolekylenes naturlige tendens til å passere gjennom en halvgjennomtrengelig membran fra en tynn til en konsentrert løsning for å oppnå likevekt. I forsøket har den tynne løsningen en konsentrasjon på null, mens den konsentrerte løsningen inneholder polymeren. Løsemiddelets bevegelse gjennom membranen gir en trykkforskjell som avhenger av polymerens konsentrasjon og molekylmasse (1) (3) (4). Anvendelsesområde: Mn mellom 20 000 og 200 000. 1.4. Dampfaseosmometri innebærer sammenligning av fordampingshastigheten til et rent løsemiddelaerosol med minst tre aerosoler som inneholder polymeren i forskjellige konsentrasjoner (1) (5) (6). Anvendelsesområde: Mn < 20 000. 2. Endegruppeanalyse Bruk av denne metoden krever kjennskap til både polymerens overordnede struktur og arten kjede som avslutter endegruppene (endegruppene må kunne skilles fra hovedskjelettet ved for eksempel NMR eller titrering/derivatisering). Bestemmelse av molekylkonsentrasjonen til endegrupper i polymeren kan føre til en verdi for molekylmassen (7) (8) (9). Anvendelsesområde: Mn opptil 50 000 (med avtakende pålitelighet). HENVISNINGER (1) Billmeyer, F. W. Jr. (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York. (2) Glover, C. A. (1975). Absolute Colligative Property Methods, Chapter 4, in Polymer Molecular Weights, Part I (ed. P. E. Slade, Jr.), Marcel Dekker, New York. (3) ASTM D 3750-79 (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) Coll, H. (1989). Membrane Osometry, in Determination of Molecular Weight (ed. A. R. Cooper), J. Wiley and Sons, pp. 25-52. (5) ASTM D 3592-77 (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (6) Morris, C. E. M. (1989). Vapour Pressure Osmometry, in Determination of Molecular Weight (ed. A. R. Cooper), J. Wiley and Sons. (7) Schröder, E. Müller, G. & Arndt, K.-F. (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, München. (8) Garmon R. G. (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 in Polymer Molecular Weights, Part I (ed. P. E. Slade, Jr.), Marcel Dekker, New York. (9) Amiya, S. et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146. VEDLEGG III B A.19 POLYMERER MED LAV MOLEKYLMASSE 1. METODE Denne metoden for gelpermeasjonskromatografi bygger på OECD TG 119 (1996). Grunnprinsipper og ytterligere tekniske opplysninger finnes i henvisningene. 1.1. Innledning Siden polymerer har så forskjellige egenskaper, er det umulig å beskrive én enkelt metode som nøyaktig angir vilkårene for separasjon og evaluering som dekker alle muligheter og særegenheter ved separasjon av polymerer. Særlig er komplekse polymersystemer ofte uegnet til gelpermeasjonskromatografi (GPC). Dersom GPC ikke kan anvendes, kan molekylmassen bestemmes ved andre metoder (se vedlegget). I slike tilfeller skal det gis en fullstendig begrunnelse for og beskrivelse av metoden som benyttes. Metoden som er beskrevet, bygger på DIN-standard 55672 (1). Detaljerte opplysninger om utførelse av forsøk og evaluering av data finnes i denne DIN-standarden. Dersom endringer i forsøksvilkårene er nødvendige, må disse endringene begrunnes. Andre standarder kan benyttes, forutsatt at det gis fullstendige henvisninger. Metoden som er beskrevet, benytter polystyrenprøver med kjent polydispersitet til kalibrering, og det er mulig at den må tilpasses for å være egnet for enkelte polymerer, for eksempel vannløselige og langkjedede, forgrenede polymerer. 1.2. Definisjoner og enheter Lav molekylmasse defineres vilkårlig som molekylmasse under 1 000 dalton. Tallmessig gjennomsnittlig molekylmasse Mn og vektmessig gjennomsnittlig molekylmasse Mw bestemmes etter følgende ligninger: der Hi er detektorsignalets høyde fra grunnlinjen for retensjonsvolumet Vi, Mi er molekylmassen til polymerfraksjonen ved retensjonsvolumet Vi, og n er antallet datapunkter. Bredden til fordelingen av molekylmassen, som er et mål på systemets dispersitet, er gitt ved forholdet Mw/Mn. 1.3. Referansestoffer Siden GPC er en relativ metode, må kalibrering foretas. Til dette benyttes vanligvis lineært oppbygde polystyrenstandarder med kjente gjennomsnittlige molekylmasser Mn og Mw og kjent, snever molekylmassefordeling. Kalibreringskurven kan brukes til bestemmelse av molekylmassen til den ukjente prøven bare dersom vilkårene for separasjon av prøven og standardene er identiske. Den sammenheng mellom molekylmassen og elueringsvolumet som bestemmes, er gyldig bare for de bestemte vilkårene ved vedkommede forsøk. Vilkårene omfatter først og fremst temperatur, løsemiddel (eller blanding av løsemidler), kromatografivilkår og separasjonskolonne eller -kolonnesystem. Molekylmassene til prøven som bestemmes på denne måten, er relative verdier og betegnes som "polystyrenekvivalente molekylmasser". Det betyr at molekylmassene kan avvike mer eller mindre fra absoluttverdiene, avhengig av strukturelle og kjemiske forskjeller mellom prøven og standardene. Dersom andre standarder benyttes, for eksempel polyetylenglykol, polyetylenoksid, polymetylmetakrylat eller polyakrylsyre, skal det begrunnes. 1.4 Prinsipp for prøvingsmetoden Både prøvens molekylmassefordeling og gjennomsnittlige molekylmasser (Mn, Mw) kan bestemmes ved GPC. GPC er en spesiell type væskekromatografi der prøven separeres ut fra de enkelte bestanddelenes hydrodynamiske volumer (2). Separasjonen utføres idet prøven passerer gjennom en kolonne som er fylt med et porøst materiale, vanligvis en organisk gel. Små molekyler kan trenge gjennom porene, mens store molekyler holdes ute. De store molekylenes bane er dermed kortere, og disse kan elueres først. Mellomstore molekyler trenger gjennom noen av porene og elueres senere. De minste molekylene, med en gjennomsnittlig hydrodynamisk radius som er mindre enn gelens porer, kan trenge gjennom alle porene. Disse elueres til slutt. I en ideell situasjon styres separasjonen utelukkende av molekylstørrelsen, men i praksis er det vanskelig å unngå en viss absorpsjonsvirkning. Uensartet kolonnepakning og dødvolumer kan forverre vilkårene (2). Deteksjonen foretas for eksempel ved måling av brytningsindeks eller UV-absorpsjon og gir en enkel fordelingskurve. For at det skal oppnås faktiske molekylmasseverdier på kurven, må kolonnen kalibreres ved at polymerer med kjent molekylmasse og helst stort sett samme struktur, for eksempel forskjellige polystyrenstandarder, ledes gjennom den. Resultatet er vanligvis en Gauss-kurve, noen ganger trukket ut i en liten hale i enden med lav molekylmasse, der vertikalaksen viser mengden (vekt) til de forskjellige eluerte molekylmassefraksjoner, og horisontalaksen viser logaritmen til molekylmassen. Innholdet av bestanddeler med lav molekylmasse utledes av denne kurven. Beregningen er nøyaktig bare dersom den lavmolekylære fraksjonen forholder seg til massen som polymeren som helhet . 1.5. Kvalitetskriterier Repeterbarheten (relativt standardavvik) for elueringsvolumet bør være bedre enn 0,3 %. Nødvendig repeterbarhet for analysen sikres ved korrigering med intern standard dersom et kromatogram vurderes tidsavhengig og ikke oppfyller nevnte kriterium (1). Tallene for polydispersitet avhenger av standardenes molekylmasser. For polystyrenstandarder er følgende verdier typiske: Mp < 2 000 Mw/Mn < 1,20 2 000 ? Mp ? 106 Mw/Mn < 1,05 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 (Mp er molekylmassen til standarden ved topphøyden.) 1.6 Beskrivelse av prøvingsmetoden 1.6.1. Tilberedning av standardløsninger av polystyren Polystyrenstandardene oppløses ved omhyggelig blanding i valgt elueringsmiddel. Ved tilberedning av løsninger skal det tas hensyn til produsentens anbefalinger. Hvilke konsentrasjoner av standardene som velges, avhenger av forskjellige faktorer, for eksempel injeksjonsvolum, løsningens viskositet og analysedetektorens følsomhet. Det største injeksjonsvolumet må tilpasses til lengden av kolonnen, slik at overbelastning unngås. Typiske injeksjonsvolumer for analytisk separasjon med GPC med en kolonne på 30 cm ? 7,8 mm er vanligvis mellom 40 og 100 µl. Større volumer er mulig, men de bør ikke overstige 250 µl. Det optimale forholdet mellom injeksjonsvolumet og konsentrasjonen må bestemmes før den faktiske kalibreringen av kolonnen. 1.6.2. Tilberedning av prøveløsningen I prinsippet gjelder de ovennevnte krav også for tilberedning av prøveløsninger. Prøven oppløses i et egnet løsemiddel, for eksempel tetrahydrofuran (THF), ved omhyggelig risting. Den skal under ingen omstendighet oppløses i ultralydbad. Om nødvendig renses prøveløsningen gjennom et membranfilter med porestørrelse mellom 0,2 og 2 µm. Forekomst av uoppløste partikler skal registreres i den endelige prøvingsrapporten, siden disse kan skyldes fraksjoner med høy molekylmasse. Det benyttes en egnet metode til å bestemme vektprosenten av de oppløste partiklene. Løsningene bør brukes innen 24 timer. 1.6.3. Korrigering for innhold av urenheter og tilsetningsstoffer Det er vanligvis nødvendig å korrigere innholdet av bestanddeler med M < 1 000 for bidrag fra ikke-polymere bestanddeler (for eksempel urenheter og/eller tilsetningsstoffer), med mindre det målte innholdet allerede er mindre enn 1 %. Dette oppnås ved direkte analyse av polymerløsningen eller GPC-eluatet. Dersom eluatet etter å ha passert gjennom kolonnen er for uttynnet for videre analyse, må det konsentreres. Det kan være nødvendig å dampe inn eluatet til det er tørt, og oppløse på nytt. Eluatet må konsentreres på en slik måte at ingen endringer forekommer i eluatet. Behandlingen av eluatet etter GPC-trinnet avhenger av analysemetoden som brukes til kvantitativ bestemmelse. 1.6.4. Utstyr GPC-utstyr består av følgende deler: - løsemiddelbeholder, - gassutskiller (om nødvendig), - pumpe, - pulsdemper (om nødvendig), - injeksjonssystem, - kromatografikolonner, - detektor, - strømningsmåler (om nødvendig), - enhet for registrering og behandling av data, - avfallsbeholder. Det må sikres at GPC-systemet er inert med hensyn til de anvendte løsemidlene (for eksempel ved bruk av stålkapillærer for THF-løsemiddelet). 1.6.5. System for injeksjon og tilførsel av løsemiddel Et bestemt volum av prøveløsningen has i kolonnen med en automatisk prøveveksler eller manuelt i et nøye avgrenset område. For hurtig tilbaketrekking eller inntrykking av stempelet i injeksjonssprøyten kan føre til endringer i den observerte molekylmassefordelingen. Systemet for tilførsel av løsemiddel bør i størst mulig grad være vibrasjonsfritt, og bør helst inneholde en pulsdemper. Strømningshastigheten skal være omkring 1 ml/min. 1.6.6. Kolonne Etter prøvens art karakteriseres polymeren ved hjelp av én enkelt kolonne eller flere seriekoplede kolonner. En rekke porøse kolonnematerialer med fastsatte egenskaper (for eksempel porestørrelse, eksklusjonsgrenser) er tilgjengelige i handelen. Valg av separasjonsgel eller kolonnelengde avhenger av både egenskapene til prøven (hydrodynamiske volumer, molekylmassefordeling) og de bestemte vilkårene for separasjon som løsemiddel, temperatur og strømningshastighet (1) (2) (3). 1.6.7. Teoretiske plater Kolonnen eller kolonnekombinasjonen som brukes til separasjonen, må karakteriseres ved antallet teoretiske plater. Dette innebærer, for THF som elueringsmiddel, at en løsning av etylbenzen eller et annet egnet ikke-polart oppløst stoff anbringes på en kolonne av kjent lengde. Antallet teoretiske plater er gitt ved følgende ligning: der N er antallet teoretiske plater, Ve er elueringsvolumet ved topphøyden, W er toppens bredde ved grunnlinjen, W1/2 er toppens bredde ved halv høyde. 1.6.8. Separasjonseffektivitet I tillegg til antallet teoretiske plater, som er en størrelse som bestemmer båndbredden, spiller også separasjonseffektiviteten en rolle, og den bestemmes av kalibreringskurvens stigning. Separasjonseffektiviteten til en kolonne er gitt ved følgende forhold: Ve,Mx - Ve,M(10Mx) / kolonnens tverrsnitt ?6,0 (cm3/cm2) der Ve,Mx er elueringsvolumet for polystyren med molekylmasse Mx, Ve,M(10Mx) er elueringsvolumet for polystyren med ti ganger så høy molekylmasse. Systemets løsningsevne defineres vanligvis som følger: R1,2 = 2 x (Ve1 - Ve2 / W1 + W2) x (1 / log10(M2/M1)) der Ve1, Ve2 er elueringsvolumene til de to polystyrenstandardene ved topphøyden, W1, W2 er toppenes bredde ved grunnlinjen M1, M2 er molekylmassene ved topphøyde (bør avvike fra hverandre med en faktor på 10). R-verdien for kolonnesystemet bør være større enn 1,7 (4). 1.6.9. Løsemidler Alle løsemidler må være av høy renhet (for THF benyttes en renhetsgrad på 99,5 %). Løsemiddelbeholderen (om nødvendig i nøytralgassatmosfære) må være tilstrekkelig stor til at kolonnen kan kalibreres og til analyse av flere prøver. Løsemiddelet må avgasses før det transporteres til kolonnen via pumpen. 1.6.10. Temperaturkontroll Temperaturen til de kritiske interne komponentene (injeksjonssløyfe, kolonner, detektor og rør og slanger) må være konstant og passe til valgt løsemiddel. 1.6.11. Detektor Formålet med detektoren er å registrere kvantitativt konsentrasjonen til prøven som elueres fra kolonnen. For å unngå unødvendig bredde på toppene må detektorcellens volum være så lite som mulig. Det må ikke være større enn 10 µl, unntatt for detektorer basert på lysspredning og viskositet. Til deteksjon brukes vanligvis differensialrefaktrometri. Dersom særlige egenskaper ved prøve eller elueringsmiddel krever det, kan imidlertid andre typer detektorer benyttes, for eksempel UV/VIS-, IR- eller viskositetsdetektorer. 2. RESULTATER OG PRØVINGSRAPPORT 2.1. Resultater Det vises til DIN-standarden (1) når det gjelder mer detaljerte evalueringskriterier og krav i forbindelse med innsamling og behandling av data. For hver prøve utføres to uavhengige prøvinger. Resultatene analyseres hver for seg. Det skal uttrykkelig angis at de målte verdiene er relative verdier som tilsvarer den benyttede standards molekylmasse Det er i alle tilfeller viktig også å bestemme data for blindprøver som er behandlet på samme måte som prøvene. Etter bestemmelse av retensjonsvolumene eller retensjonstidene (eventuelt korrigert ved hjelp av en intern standard) settes log Mp-verdiene (der Mp er kalibreringsstandardens topphøyder) av mot en av disse størrelsene. Minst to kalibreringspunkter er nødvendige per molekylmassedekade, og minst fem målepunkter kreves for hele kurven, som bør dekke prøvens anslåtte molekylmasse. Kalibreringskurvens endepunkt for lav molekylmasse defineres ved n-heksylbenzen eller et annet egnet ikke-polart oppløst stoff. Den delen av kurven som tilsvarer molekylmasser under 1 000, bestemmes og korrigeres etter behov for urenheter og tilsetningsstoffer. Elueringskurvene evalueres vanligvis ved hjelp av et system for elektronisk databehandling. For manuell beregning vises det til ASTM D 3536-91 (3). Uløselige polymerer som måtte være igjen i kolonnen, vil etter all sannsynlighet ha en høyere molekylmasse enn den løselige fraksjonen, og dersom dette ikke tas i betraktning, vil innholdet av bestanddeler med lav molekylmasse overvurderes. Vedlegget inneholder en veiledning i korrigering av innholdet av lavmolekylære bestanddeler for uløselig polymer. Fordelingskurven må framlegges i form av en tabell eller en figur (differensialfrekvens eller prosentsum mot log M). I den grafiske framstillingen bør en molekylmassedekade normalt svare til ca. 4 cm i bredde og topphøyden være ca. 8 cm. For integralfordelingskurver bør forskjellen mellom 0 og 100 % på ordinataksen være ca. 10 cm. 2.2. Prøvingsrapport Prøvingsrapporten skal omfatte følgende opplysninger: 2.2.1. Prøvingsstoffet - tilgjengelige opplysninger om prøvingsstoffet (art, tilsetningsstoffer, urenheter), - beskrivelse av behandlingen av prøven, observasjoner, problemer. 2.2.2. Apparatur - beholder til elueringsmiddel, inert gass, avgassing av elueringsmiddelet, sammensetning av elueringsmiddelet, urenheter, - pumpe, pulsdemper, injeksjonssystem, - separasjonskolonner (produsent, alle opplysninger om kolonnenes egenskaper, for eksempel porestørrelse og separasjonsmateriale, antall, lengde og rekkefølge av de anvendte kolonnene), - antall teoretiske plater i kolonnen (eller kolonnekombinasjonen), separasjonseffektivitet (systemets løsningsevne), - opplysninger om toppenes symmetri, - kolonnetemperatur, type temperaturkontroll, - detektor (måleprinsipp, type, kuvettevolum), - eventuell strømningsmåler (produsent, måleprinsipp), - system for registrering og behandling av data (maskinvare og programvare). 2.2.3. Kalibrering av systemet - detaljert beskrivelse av metoden som brukes til framstilling av kalibreringskurven, - opplysninger om kvalitetskriterier for denne metoden (for eksempel korrelasjonsfaktor, feilsum av kvadrater), - opplysninger om alle ekstrapoleringer, antakelser og tilnærminger gjort under forsøket og evaluering og behandling av data, - alle målinger som er brukt til framstilling av kalibreringskurven, må dokumenteres i en tabell som omfatter følgende opplysninger for hvert kalibreringspunkt: - prøvens navn, - prøvens produsent, - karakteristiske verdier av standardene Mp, Mn, Mw og Mw/Mn, som angitt av produsenten eller utledet ved etterfølgende målinger, sammen med opplysninger om bestemmelsesmetoden, - injeksjonsvolum og injeksjonskonsentrasjon, - Mp-verdi benyttet ved kalibreringen, - elueringsvolum eller korrigert retensjonstid målt ved topphøyden, - Mp beregnet ved topphøyden, - prosentvis feil for den beregnede Mp og kalibreringsverdien. 2.2.4. Opplysninger om innholdet av lavmolekylære bestanddeler - beskrivelse av metodene som er benyttet ved analysen, og måten forsøkene er utført på, - opplysninger om prosentdelen av lavmolekylære bestanddeler (w/w) i forhold til prøven i sin helhet, - opplysninger om urenheter, tilsetningsstoffer og andre ikke-polymere bestanddeler i vektprosent i forhold til prøven i sin helhet. 2.2.5. Evaluering - evaluering på tidsbasis: metoder benyttet for å sikre den nødvendige reproduserbarhet (korrigeringsmetode, intern standard osv.) - opplysninger om hvorvidt evalueringen er foretatt på grunnlag av elueringsvolumet eller retensjonstiden, - opplysninger om begrensningene ved evalueringen dersom en topp ikke er fullstendig analysert, - beskrivelse av eventuelle utglattingsmetoder, - framgangsmåter for tilberedning og forbehandling av prøven, - eventuell forekomst av uoppløste partikler, - injeksjonsvolum (µl) og injeksjonskonsentrasjon (mg/ml), - observasjoner som tyder på virkninger som fører til avvik fra den ideelle GPC-profilen, - detaljert beskrivelse av alle endringer i prøvingsmetodene, - nærmere opplysninger om feilintervaller, - eventuelle andre opplysninger og observasjoner som er relevante for tolkningen av resultatene. 3. HENVISNINGER (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. (2) Yau, W. W., Kirkland and Bly, D. D. (eds.) (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC), American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. Vedlegg Korrigering av innholdet av lavmolekylære bestanddeler for uløselige polymerer Forekomst av uløselige polymerer i en prøve vil medføre massetap under GPC-analysen. Den uløselige polymeren holdes irreversibelt tilbake i kolonnen, mens den løselige delen av prøven passerer gjennom kolonnen. Dersom økningen i polymerens brytningsindeks (dn/dc) kan anslås eller måles, kan tapet av prøvemasse i kolonnen anslås. I så fall foretas korrigeringen ved hjelp av en ekstern kalibrering med standardmaterialer med kjent konsentrasjon og dn/dc for å kalibrere refraktometerets utslag. I eksempelet nedenfor er det brukt en standard av poly(metylmetakrylat) (pMMA). Ved ekstern kalibrering for analyse av akrylpolymerer analyseres en pMMA-standard med kjent konsentrasjon i tetrahydrofuran ved GPC, og resultatdataene brukes til å finne refraktometerkonstanten etter følgende ligning: K = R / (C ? V ? dn/dc) der K er refraktometerkonstanten (i mikrovolt-sekund/ml), R er pMMA-standardens utslag (i mikrovolt-sekund), C er pMMA-standardens konsentrasjon (i mg/ml), V er injeksjonsvolumet (i ml), og dn/dc er økningen i brytningsindeks for pMMA i tetrahydrofuran (i ml/mg). Følgende data er typiske for en pMMA-standard: R = 2 937 891, C = 1,07 mg/ml, V = 0,1 ml, dn/dc = 9 ? 10-5 ml/mg. Den resulterende K-verdien, 3,05 ? 1011, brukes deretter til å beregne det teoretiske detektorutslaget dersom 100 % av den injiserte polymeren er eluert gjennom detektoren. VEDLEGG III C A.20 POLYMERERS EGENSKAPER VED OPPLØSNING/EKSTRAKSJON I VANN 1. METODE Metoden som er beskrevet, er en gjengivelse av den reviderte versjonen av OECD TG 120 (1997). Ytterligere tekniske opplysninger finnes i henvisning 1. 1.1. Innledning For enkelte polymerer, for eksempel emulsjonspolymerer, kan det være nødvendig å gjøre forberedelser før metoden beskrevet nedenfor kan benyttes. Metoden kan ikke anvendes på væskepolymerer eller polymerer som reagerer med vann under prøvingsvilkår. Dersom metoden er upraktisk eller uegnet, kan løseligheten/ekstraksjonen undersøkes ved andre metoder. I slike tilfeller skal det gis fullstendige opplysninger og begrunnelse for den anvendte metoden. 1.2. Referansestoffer Ingen. 1.3 Prinsipp for prøvingsmetoden Polymerers egenskaper ved oppløsning/ekstraksjon i et vandig medium bestemmes ved hjelp av kolbemetoden (se A.6 Vannløselighet - kolbemetoden) med endringene beskrevet nedenfor. 1.4. Kvalitetskriterier Ingen. 1.5 Beskrivelse av prøvingsmetoden 1.5.1. Utstyr Følgende utstyr kreves til metoden: - findelingsapparat, f.eks. kvern, til framstilling av partikler av kjent størrelse, - risteapparat med mulighet for temperaturkontroll, - membranfilter, - egnet analyseutstyr, - standardsikter. 1.5.2. Tilberedning av prøven En representativ prøve reduseres først til en partikkelstørrelse på mellom 0,125 og 0,25 mm ved hjelp av egnede sikter. Avkjøling kan være nødvendig av hensyn til prøvens stabilitet eller for kverningen. Materialer av gummiaktig art kan pulveriseres ved temperaturen for flytende nitrogen (1). Dersom den påkrevde partikkelstørrelsen ikke kan oppnås, bør det treffes tiltak for å redusere partikkelstørrelsen så mye som mulig, og resultatet dokumenteres. I rapporten må det angis på hvilken måte den pulveriserte prøven ble lagret før prøvingen. 1.5.3. Framgangsmåte Tre prøver à 10 g av prøvingsstoffet veies opp i hver av tre beholdere utstyrt med glasspropper, og 1 000 ml vann tilsettes i hver beholder. Dersom det er upraktisk å håndtere mer enn 10 g polymer, anvendes den største mengde som kan håndteres, og vannmengden justeres tilsvarende. Beholderne lukkes tett til og ristes ved 20 ?C. Det anvendes en riste- eller røreinnretning som kan operere ved konstant temperatur. Etter 24 timer sentrifugeres eller filtreres innholdet i hver beholder, og polymerkonsentrasjonen i den klare, vandige fasen bestemmes ved egnet analysemetode. Dersom det ikke finnes noen egnet analysemetode for den vandige fasen, kan den samlede løseligheten/ekstraksjonen bestemmes ut fra tørrvekten til filterresten eller sentrifugeringsbunnfallet. Det er vanligvis nødvendig å skille kvantitativt mellom urenheter og tilsetningsstoffer på den ene side og lavmolekylære bestanddeler på den annen side. Ved gravimetrisk bestemmelse er det også viktig å utføre en blindprøving, der det ikke benyttes noe stoff som skal prøves, for å ta høyde for rester som skyldes prøvingsmetoden. Polymerers løselighet/ekstraksjon i vann ved 37 ?C ved pH 2 og pH 9 kan bestemmes på samme måte som beskrevet for utførelsen av forsøket ved 20 ?C. pH-verdiene kan oppnås ved tilsetning av egnede bufferløsninger eller egnede syrer eller baser, for eksempel saltsyre, natrium- eller kaliumhydroksid av analysekvalitet eller NH3. Avhengig av anvendt analysemetode må det utføres en eller to prøvinger. Dersom det finnes tilstrekkelig spesifikke metoder for direkte analyse av den vandige fasen for polymerkomponenten, bør det være nok med en prøving som beskrevet ovenfor. Dersom det ikke finnes slike metoder, og bestemmelse av løselighet/ekstraksjon for polymeren er begrenset til direkte analyse ved bestemmelse av bare totalt organisk karbon (TOC) i det vandige ekstraktet, bør det utføres en tilleggsprøving. Denne tilleggsprøvingen bør også utføres tre ganger, med en tidel så store polymerprøver og samme mengde vann som ble brukt i den første prøvingen. 1.5.4. Analyse 1.5.4.1. Prøving utført med én prøvestørrelse Det er mulig at det finnes metoder for direkte analyse av polymerkomponenter i den vandige fasen. Alternativt kan indirekte analyse av oppløste/ekstraherte polymerkomponenter, der den samlede mengden løselige deler bestemmes og det korrigeres for ikke-polymerspesifikke komponenter, også vurderes. Analyse av den vandige fasen for samlet innhold av polymerforbindelser er mulig ved: en tilstrekkelig følsom metode, for eksempel - TOC-bestemmelse ved nedbryting til CO2 med persulfat eller dikromat etterfulgt av IR-analyse eller kjemisk analyse, - atomabsorpsjonsspektroskopi (AAS) eller tilsvarende induktivt koplet plasma-optisk emisjonsspektroskopi (ICP) for silisium- eller metallholdige polymerer, - UV-absorpsjon eller spektrofluorimetri for arylpolymerer, - LC-MS for prøver med lav molekylmasse, eller ved vakuuminndamping av den vandige ekstrakten til tørrhet og analyse av resten ved spektroskopi (IR, UV osv.) eller AAS/ICP. Dersom analyse av den vandige fasen ikke er praktisk gjennomførbart, ekstraheres det vandige ekstraktet med et organisk løsemiddel som ikke kan blandes med vann, for eksempel et klorert hydrokarbon. Deretter inndampes løsemiddelet, og resten analyseres som beskrevet ovenfor for innhold av den aktuelle polymeren. Bestanddeler i denne resten som identifiseres som urenheter eller tilsetningsstoffer, trekkes fra ved bestemmelsen av selve polymerens løselighet/ekstraksjon. Dersom det finnes relativt store mengder av slike materialer, kan det være nødvendig å foreta for eksempel HPLC- eller GC-analyse av resten for å skjelne urenheter fra monomerer og monomerderivater, slik at det virkelige innhold av sistnevnte kan bestemmes. I noen tilfeller kan enkel inndamping av det organiske løsemiddelet til tørrhet og veiing av den tørre resten være tilstrekkelig. 1.5.4.2. Prøving utført med to forskjellige prøvestørrelser Alle vandige ekstrakter analyseres for TOC. Gravimetrisk bestemmelse foretas av den uoppløste/ikke-ekstraherte delen av prøven. Dersom det etter sentrifugering eller filtrering av innholdet i hver beholder fortsatt sitter fast polymerrester på beholderens vegg, skylles beholderen med filtratet til beholderen er fri for alle synlige rester. Deretter sentrifugeres eller filtreres filtratet igjen. Restene som blir igjen på filteret eller i sentrifugeglasset, tørkes ved 40 ?C under vakuum og veies. Tørkingen fortsetter til konstant vekt nås. 2. RESULTATER 2.1. Prøving utført med én prøvestørrelse Resultatene for hver enkelt av de tre kolbene og gjennomsnittsverdiene angis og uttrykkes i masseenheter per volum av løsningen (vanligvis mg/l) eller masseenheter per masse polymerprøve (vanligvis mg/g). Dessuten angis vekttapet i prøven (beregnet som vekten av det oppløste stoffet dividert med prøvens opprinnelige vekt). Relative standardavvik beregnes. Enkelttall angis for den samlede stoffmengden (polymer + nødvendige tilsetningsstoffer osv.) og for polymeren alene (det vil si etter fratrekk av bidraget fra slike tilsetningsstoffer). 2.2. Prøving utført med to forskjellige prøvestørrelser De enkelte TOC-verdiene til de vandige ekstraktene fra de to trippelforsøkene og gjennomsnittsverdien for hvert forsøk skal angis, uttrykt som masseenheter per volum løsning (vanligvis mgC/g). Dersom det ikke er noen forskjell mellom resultatene for høyt og lavt forhold mellom prøve og vannvolum, kan det tyde på at alle ekstraherbare komponenter faktisk er ekstrahert. I så fall er direkte analyse normalt ikke nødvendig. Vekten av hver enkelt rest angis i prosentdel av prøvenes opprinnelige vekt. Gjennomsnittsverdiene beregnes for hvert forsøk. Forskjellene mellom 100 og prosentdelene som blir funnet, representerer prosentdelene av løselig og ekstraherbart materiale i den opprinnelige prøven. 3. PRØVINGSRAPPORT 3.1. Prøvingsrapport Prøvingsrapporten skal omfatte følgende opplysninger: 3.1.1. Prøvingsstoff - tilgjengelige opplysninger om prøvingsstoffet (art, tilsetningsstoffer, urenheter, innhold av lavmolekylære bestanddeler). 3.1.2. Forsøksvilkår - beskrivelse av anvendte framgangsmåter og forsøksvilkår, - beskrivelse av analyse- og deteksjonsmetoder. 3.1.3. Resultater - resultater for løselighet/ekstraherbarhet i mg/l; enkeltverdier og gjennomsnittsverdier for ekstraksjonsforsøkene i de forskjellige løsningene, oppdelt etter polymerinnhold og urenheter, tilsetningsstoffer osv., - resultater for løselighet/ekstraherbarhet i mg/g polymer, - TOC-verdier for vandige ekstrakter, vekt av oppløst stoff og beregnet prosentdel, dersom det er foretatt måling, - pH for hver prøve, - opplysninger om verdier oppnådd under blindprøvinger, - om nødvendig henvisning til den kjemiske ustabiliteten til prøvingsstoffet, både under prøvingsprosessen og analyseprosessen, - alle opplysninger som er viktige for tolking av resultatene. 4. HENVISNINGER (1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke. VEDLEGG III D C.13 BIOAKKUMULERING: GJENNOMSTRØMNINGSFORSØK MED FISK 1. METODE Denne bioakkumuleringsmetoden er en gjengivelse av OECD TG 305 (1996). 1.1. Innledning Denne metoden beskriver en framgangsmåte for karakterisering av visse stoffers bioakkumuleringspotensial i fisk under gjennomstrømningsvilkår. Selv om gjennomstrømningsforsøk langt er å foretrekke, kan semi-statiske forsøk tillates, forutsatt at gyldighetskriteriene oppfylles. Metoden er tilstrekkelig detaljert til at forsøket kan utføres, samtidig som det er tilstrekkelig frihet til å tilpasse tilretteleggingen av forsøkene til de aktuelle laboratorievilkårene og til å variere forsøksstoffenes egenskaper. Den er særlig egnet til stabile, organiske kjemikalier med log Pow-verdier mellom 1,5 og 6,0 (1), men kan også benyttes for superlipofile stoffer (med log Pow > 6,0). Den forhåndsberegnede bioakkumuleringsfaktoren (BCF), iblant kalt KB, for slike superlipofile stoffer vil sannsynligvis være høyere enn den verdi av likevektsbioakkumuleringsfaktoren (BCFSS) som kan forventes funnet ved laboratorieforsøk. Forhåndsberegninger av bioakkumuleringsfaktoren for organiske kjemikalier med log Pow-verdier opptil ca. 9,0 kan foretas ved hjelp av ligningen til Bintein et al (2). Blant parametrene som karakteriserer bioakkumuleringspotensialet, er hastighetskonstanten for opptak (k1), hastighetskonstanten for utskilling (k2) og BCFSS. Forsøksstoffer som er merket som radioaktive, kan lette analysen av vann- og fiskeprøver, og kan benyttes til å avgjøre om det skal foretas identifikasjon og kvantitativ bestemmelse av nedbrytingsprodukter. Dersom samlede radioaktive rester måles (for eksempel ved forbrenning eller oppløsning av vev), baseres BCF på den opprinnelige forbindelsen, eventuelle tilbakeholdte metabolitter og assimilert karbon. BCF basert på samlede radioaktive rester kan derfor ikke direkte sammenlignes med BCF utledet ved spesifikk kjemisk analyse av den opprinnelige forbindelsen alene. Ved undersøkelser med radioaktivt merkede stoffer kan det benyttes rensemetoder for å bestemme BCF basert på den opprinnelige forbindelsen, og de viktigste metabolittene kan karakteriseres dersom det anses som nødvendig. Det er også mulig å kombinere en undersøkelse av stoffskifte hos fisk med en bioakkumuleringsundersøkelse ved analyse og identifikasjon av rester i vev. 1.2. Definisjoner og enheter Biokonsentrasjon/bioakkumulering er en økning i konsentrasjonen av forsøksstoffet i eller på en organisme (eller bestemte vev fra den) i forhold til konsentrasjonen av forsøksstoff i det omgivende mediet. Bioakkumuleringsfaktoren (BCF eller KB) på et gitt tidspunkt under opptaksfasen av dette akkumuleringsforsøket er konsentrasjonen av forsøksstoff i/på fiskene eller bestemte vev fra dem (Cf i µg/ml (ppm)) dividert med konsentrasjonen av det kjemiske stoffet i det omgivende mediet (Cw i µg/ml (ppm)). Likevektsbioakkumuleringsfaktoren (BCFSS eller KB) endrer seg ikke vesentlig over et lengre tidsrom, idet konsentrasjonen av forsøksstoffet i det omgivende mediet er konstant i løpet av dette tidsrommet. Et platå eller en likevektstilstand nås i den grafiske framstillingen av forsøksstoffet i fisk (Cf) mot tiden når kurven blir parallell med tidsaksen og tre påfølgende analyser av Cf utført på prøver tatt med minst to dagers mellomrom er innenfor ± 20 % av hverandre, og det ikke er noen vesentlige forskjeller mellom de tre prøvetakingsperiodene. Ved gruppering av prøver til analyse kreves minst fire påfølgende analyser. For forsøksstoffer som opptas langsomt, vil et intervall på sju dager være mer hensiktsmessig. Biokonsentrajonsfaktorer som beregnes direkte ut fra kinetiske hastighetskonstanter (k1/k2), betegnes som kinetiske konsentrasjonsfaktorer, BCFk. Fordelingskoeffisienten oktanol/vann (Pow) er forholdet mellom et kjemisk stoffs løselighet i n-oktanol og vann ved likevekt (metode A.8), også uttrykt som Kow. Logaritmen til Pow brukes som indikasjon på et kjemisk stoffs potensial for bioakkumulering i vannorganismer. Eksponeringsfasen eller opptaksfasen er det tidsrom da fiskene eksponeres for forsøksstoffet. Hastighetskonstanten for opptak (k1) er den numeriske verdien som definerer hastigheten for konsentrasjonsøkningen av forsøksstoffet, i/på forsøksfisker (eller bestemte vev fra dem) når fiskene eksponeres for stoffet (k1 uttrykkes i dag-1). Utskillingsfasen er det tidsrom etter overføringen av forsøksfiskene fra et medium med forsøksstoffet til et medium uten stoffet da utskillingen (eller nettotapet) av stoffet fra fiskene (eller bestemte vev fra dem) undersøkes. Hastighetskonstanten for utskilling (k2) er den numeriske verdien som definerer hastigheten for konsentrasjonsreduksjon av forsøksstoffet i forsøksfiskene (eller bestemte vev fra dem) etter overføring av forsøksfiskene fra et medium med forsøksstoffet til et medium uten stoffet (k2 uttrykkes i dag-1). 1.3. Prinsipp for forsøksmetoden Forsøket består av to faser: eksponeringsfasen (opptaksfasen) og utskillingsfasen. Under opptaksfasen eksponeres atskilte grupper av fisk av én art for minst to konsentrasjoner av forsøksstoffet. Deretter overføres de til et medium som er fritt for forsøksstoffet, for utskillingsfasen. Utskillingsfasen er alltid nødvendig, med mindre opptaket av forsøksstoffet under opptaksfasen har vært ubetydelig (f.eks. BCF < 10). Konsentrasjonen av forsøksstoffet i/på fiskene (eller bestemte vev fra dem) følges i begge faser av forsøket. I tillegg til de to forsøkskonsentrasjonene holdes en gruppe med kontrollfisk under identiske vilkår, bortsett fra at det ikke benyttes noe forsøksstoff, slik at eventuelle skadevirkninger som observeres i bioakkumuleringsforsøket, kan sammenholdes med en tilsvarende kontrollgruppe og bakgrunnskonsentrasjoner av forsøksstoffet kan bestemmes. Opptaksfasen varer i 28 dager, med mindre det påvises at likevekt er nådd tidligere. Lengden på opptaksfasen og tiden det tar til likevekt inntrer, kan forutsies ut fra ligningene i vedlegg 3. Utskillingsperioden begynner deretter med overføring av fiskene til samme medium, men uten forsøksstoffet, i en annen, ren beholder. Om mulig beregnes bioakkumuleringsfaktoren både som forholdet (BCFSS) mellom konsentrasjonen i fiskene (Cf) og i vannet (Cw) ved likevekt og som kinetisk bioakkumuleringsfaktor (BCFk) som forholdet mellom hastighetskonstantene for opptak (k1) og utskilling (k2), idet kinetikken antas å være av første orden. Dersom det er åpenbart at kinetikken ikke er av første orden, må mer komplekse modeller benyttes (vedlegg 5). Dersom likevekt ikke oppnås innen 28 dager, forlenges opptaksfasen til likevekt nås, men høyst til 60 dager; deretter begynner utskillingsfasen. Hastighetskonstanten for opptak, hastighetskonstanten for utskilling (eller konstantene dersom mer komplekse modeller benyttes), bioakkumuleringsfaktoren, og om mulig, sannsynlighetsgrensene for hver av disse parametrene beregnes ut fra den modellen som best beskriver de målte konsentrasjonene av forsøksstoffet i fisk og vann. BCF uttrykkes som en funksjon av fiskens samlede våtvekt. I særlige tilfeller kan imidlertid bestemte vev eller organer (for eksempel muskelvev eller lever) benyttes dersom fisken er tilstrekkelig stor eller fisken kan deles opp i spiselige (filet) og uspiselige (innvoller) deler. Siden det for mange organiske stoffer er en klar sammenheng mellom potensialet for bioakkumulering og lipofilitet, er det en tilsvarende sammenheng mellom forsøksfiskens lipidinnhold og den observerte bioakkumuleringen av slike stoffer. For å redusere denne avvikskilden i forsøksresultatene for stoffer med høy lipofilitet (dvs. med log Pow > 3) bør bioakkumuleringen uttrykkes ikke bare i forhold til samlet kroppsvekt, men også i forhold til lipidinnholdet. Lipidinnholdet bør om mulig bestemmes på samme biologiske materiale som brukes til å bestemme konsentrasjonen av forsøksstoffet. 1.4. Opplysninger om forsøksstoffet Før bioakkumuleringsforsøket utføres, må følgende opplysninger om forsøksstoffet være kjent: a) løselighet i vann, b) fordelingskoeffisienten oktanol/vann, Pow (også betegnet som Kow, bestemt ved en HPLC-metode i A.8), c) hydrolyse, d) fotolyse i vann bestemt ved bestråling med sollys eller simulert sollys under samme bestrålingsvilkår som ved forsøket med bioakkumulering (3), e) overflatespenning (dvs. for stoffer der log Pow ikke kan bestemmes), f) damptrykk, g) umiddelbar biologisk nedbrytbarhet (dersom relevant). Blant andre nødvendige opplysninger er toksisiteten overfor fiskearten som benyttes i forsøket, helst asymptotisk LC50 (dvs. tidsuavhengig). Det må foreligge en egnet analysemetode med kjent pålitelighet, nøyaktighet og følsomhet til kvantitativ bestemmelse av forsøksstoffet i forsøksløsningene og i biologisk materiale samt opplysninger om tilberedning og lagring av prøven. Analytisk påvisningsgrense for forsøksstoffet i vann og fiskevev må også være kjent. Dersom et 14C-merket forsøksstoff benyttes, skal den prosentdelen av radioaktivitet som skyldes urenheter, være kjent. 1.5. Forsøkets gyldighet Følgende vilkår må være oppfylt for at et forsøk skal være gyldig: - temperaturvariasjonen må ikke være større enn ± 2 ?C, - konsentrasjonen av oppløst oksygen må ikke komme under 60 % metning, - konsentrasjonen av forsøksstoffet i kamrene skal holdes innenfor ± 20 % av gjennomsnittet av de målte verdiene under opptaksfasen, - dødeligheten og andre skadevirkninger/sykdommer må ved forsøkets avslutning være høyst 10 % både i kontrollgruppen og blant de behandlede fiskene; dersom forsøket strekker seg over flere uker eller måneder, må dødsfall og andre skadevirkninger i begge grupper være høyst 5 % per måned og høyst 30 % i alt. 1.6. Referanseforbindelser Det kan være nyttig å benytte referanseforbindelser med kjent bioakkumuleringspotensial til kontroll av forsøksmetoden ved behov. Ingen bestemte stoffer kan imidlertid anbefales ennå. 1.7 Beskrivelse av forsøksmetoden 1.7.1. Apparatur Bruk av materialer som kan oppløses, adsorbere, absorbere eller avgi stoffer og ha skadelig virkning på fiskene, bør omhyggelig unngås i alle deler av utstyret. Standard rektangulære eller sylinderformede beholdere av kjemisk inert materiale og med kapasitet tilpasset mengden av fisk, kan benyttes. Rør laget av bøyelig plast skal brukes i minst mulig grad. Det bør helst brukes rør og slanger av teflon (R), rustfritt stål og/eller glass. Erfaring har vist at det for stoffer med høye absorpsjonskoeffisienter, for eksempel syntetiske pyretroider, kan være nødvendig å bruke silanisert glass. I slike situasjoner må utstyret kasseres etter bruk. 1.7.2. Vann Naturlig vann brukes vanligvis i forsøket og bør tas fra en ikke-forurenset kilde med jevn kvalitet. Vann til fortynning må være av en slik kvalitet at den valgte fiskearten kan overleve akklimatiserings- og forsøksperioden uten å framvise unormal(t) utseende eller atferd. Ideelt sett bør det påvises at forsøksartene kan overleve, vokse og formere seg i fortynningsvann (dvs. i laboratoriekultur eller giftighetsforsøk over en hel livssyklus). Vannet skal ihvertfall beskrives ved sin pH, hardhet, samlede tørrstoffinnhold, sitt totale organiske karbon og fortrinnsvis også sitt innhold av ammonium, nitritt og sin alkalitet samt, for marine arter, saltinnhold. Parametrene som er viktige for optimal fiskevelferd, er velkjente, men vedlegg I gir anbefalte høyeste konsentrasjoner for en rekke parametrer for ferskvann og saltvann til forsøk. Vannet skal være av konstant kvalitet under hele forsøket. pH-verdien skal være mellom 6,0 og 8,5, men for et gitt forsøk skal den ligge innenfor ± 0,5 pH-enheter. For å sikre at fortynningsvann ikke påvirker forsøksresultatet på en utilbørlig måte (for eksempel ved kompleksdanning av forsøksstoffet) eller virker negativt på fiskebestanden, skal det regelmessig tas prøver til analyse. Bestemmelse av tungmetaller (f.eks. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), viktige anioner og kationer (f.eks. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), plantevernmidler (f.eks. totale organiske fosforforbindelser og totale organiske klorforbindelser), totalt organisk karbon og suspenderte faste stoffer foretas for eksempel hver tredje måned dersom fortynningsvannet er kjent for å holde relativt konstant kvalitet. Dersom vannkvaliteten er påvist å være konstant i minst ett år, kan bestemmelsene foretas sjeldnere (for eksempel hver sjette måned). Både det naturlige partikkelinnholdet og totalt organisk karbon (TOC) i fortynningsvannet bør være så lavt som mulig, slik at absorpsjon av forsøksstoffet i organisk materiale unngås, siden det kan nedsette dets biotilgjengelighet (4). Høyeste akseptable verdi er 5 mg/l for partikler (faste stoffer som ikke går gjennom et 0,45 µm filter) og 2 mg/l for totalt organisk karbon (se vedlegg 1). Om nødvendig filtreres vannet før bruk. Bidraget til innhold av totalt organisk karbon i vannet fra forsøksfiskene (ekskrementer) og fôrrester bør være så lavt som mulig. Under hele forsøket skal konsentrasjonen av organisk karbon i beholderen ikke overstige konsentrasjonen av organisk karbon som stammer fra forsøksstoffet, og dersom det er brukt, fra løsemiddelet med mer enn 10 mg/l (± 20 %). 1.7.3. Forsøksløsninger Det framstilles en stamløsning av forsøksstoff med en passende konsentrasjon. Stamløsningen bør helst framstilles ved ganske enkelt å blande eller riste forsøksstoffet i fortynningsvannet. Bruk av løsemidler eller dispergeringsmidler (oppløsende stoffer) anbefales ikke, men kan i enkelte tilfeller være nødvendig for å oppnå en passe konsentrert stamløsning. Blant løsemidlene som kan brukes, er etanol, metanol, etylenglykolmonometyleter, etylenglykoldimetyleter, dimetylformamid og trietylenglykol. Blant dispergeringsmidlene som kan brukes, er Cremophor RH40, Tween 80, metylcellulose 0,01 % og HCO-40. Det bør utvises forsiktighet ved bruk av biologisk lett nedbrytbare agenser, da de kan forårsake problemer og bakterievekst i forsøk med gjennomstrømning. Forsøksstoffet kan være merket for radioaktivitet og må være av høyeste renhet (f.eks. helst > 98 %). For forsøk med gjennomstrømning kreves et system som kontinuerlig avgir og fortynner en stamløsning av forsøksstoffet (for eksempel doseringspumpe, proporsjonsfortynner, metningssystem), for å tilføre forsøksskonsentrasjoner til forsøkskamrene. En utskiftning av innholdet i forsøksbeholderen minst fem ganger daglig tilstrebes. Gjennomstrømningsmåten foretrekkes, men dersom dette ikke er mulig (for eksempel dersom forsøksorganismene tar skade), kan en semi-statisk teknikk benyttes, forutsatt at gyldighetskriteriene oppfylles. Gjennomstrømningshastighetene for stamløsningene og fortynningsvannet kontrolleres 48 timer før forsøket og deretter minst hver dag under forsøket. Ved denne kontrollen bestemmes gjennomstrømningshastigheten i hvert forsøkskammer, og det sikres at denne ikke varierer med mer enn 20 % innenfor hvert kammer eller mellom kamrene. 1.7.4. Valg av art Blant de viktige kriteriene for valg av art er at den skal være lett tilgjengelig, kunne fås i hensiktsmessige størrelser og lett kunne holdes i laboratorium. Blant andre kriterier for valg av fiskeart er artens rekreasjonsbetydning, kommersielle betydning og økologiske betydning samt dens følsomhet i forhold til andre arter og gode erfaringer med den fra tidligere forsøk. I tllegg 2 er det angitt anbefalte forsøksarter. Andre arter kan benyttes, men det kan være nødvendig å tilpasse forsøksmetoden, slik at forsøksvilkårene blir passende. Begrunnelse for valg av art og forsøksmetode skal i dette tilfellet angis i rapporten. 1.7.5. Oppbevaring av fisk Stampopulasjonen av fisk akklimatiseres i minst to uker i vann ved forsøkstemperatur og fôres hele tiden med samme type fôr som skal benyttes under forsøket. Etter en 48-timers tilpasningsperiode registreres dødeligheten, idet følgende kriterier anvendes: - dødelighet over 10 % etter sju dager: hele partiet forkastes, - dødelighet mellom 5 og 10 % etter sju dager: ytterligere sju dagers akklimatisering, - dødelighet på under 5 % etter sju dager: partiet godtas - dersom dødeligheten etter ytterligere sju dager er over 5 %, forkastes hele partiet. Det sikres at fiskene som benyttes i forsøket, er fri for observerbare sykdommer og anomalier. Eventuelle syke fisk forkastes. Fisk skal ikke behandles mot sykdom de siste to ukene før forsøket eller under forsøket. 1.8. Utførelse av forsøket 1.8.1. Innledende forsøk Det kan være nyttig å utføre et innledende forsøk for å optimalisere forsøksvilkårene for det endelige forsøket, for eksempel valg av konsentrasjon(er) av forsøksstoffet og varigheten av opptaks- og utskillingsfasene. 1.8.2. Eksponeringsvilkår 1.8.2.1. Opptaksfasens varighet Opptaksfasens varighet kan forutsies på grunnlag av praktisk erfaring (for eksempel fra en innledende undersøkelse eller et annet kjemisk stoff med lignende akkumuleringsegenskaper) eller på grunnlag av bestemte empiriske sammenhenger, ut fra kunnskap om forsøksstoffets løselighet i vann eller dets fordelingskoeffisient oktanol/vann (se vedlegg 3). Opptaksfasen bør vare i 28 dager, med mindre det kan påvises at likevekt er nådd tidligere. Dersom likevekt ikke er nådd i løpet av 28 dager, forlenges opptaksfasen og målingene fortsetter til likevekt oppnås eller i høyst 60 dager. 1.8.2.2. Utskillingsfasens varighet Normalt er et tidsrom på halvparten av opptaksfasen tilstrekkelig til å oppnå en passende reduksjon (f.eks. 95 %) i innholdet av stoffet (se vedlegg 3 for forklaring av overslaget). Dersom det tidsrommet som kreves for å oppnå 95 % tap er uforholdsmessig langt, for eksempel over dobbelt så langt som opptaksfasens normale varighet (dvs. mer enn 56 dager), kan tidsrommet reduseres (dvs. til konsentrasjonen av forsøksstoffet, er lavere enn 10 % av konsentrasjonen ved likevekt). For stoffer med mer komplekse opptaks- og utskillingsmønstre enn modellen der fisken betraktes som en helhet, altså der førsteordens kinetikk gjelder, må det tillates en lengre utskillingsfase for bestemmelse av hastighetskonstanten for utskilling. Tidsrommets varighet kan for eksempel bestemmes ut fra hvor lenge konsentrasjonen av forsøksstoffet i fiskene er høyere enn påvisningsgrensen. 1.8.2.3. Antall forsøksfisk Antallet fisk per forsøkskonsentrasjon velges slik at minst fire fisk per prøve er tilgjengelig ved hver prøvetaking. Dersom større statistisk styrke er ønskelig, må antallet fisk per prøve økes. Dersom voksen fisk benyttes, angis det om det benyttes hanner eller hunner eller begge deler i forsøket. Dersom begge kjønn benyttes, skal det dokumenteres at eventuelle forskjeller i lipidinnholdet mellom kjønnene er ubetydelige før forsøkets begynnelse; det kan være nødvendig å gruppere hannfisk og hunnfisk hver for seg. I hvert enkelt forsøk skal fisk av lignende vekt velges, slik at minste fisk ikke er mindre enn 2/3 av vekten av den største. Alle skal være av samme årskull og komme fra samme kilde. Siden vekt og alder for fisk iblant kan synes å ha betydelig innvirkning på BCF-verdiene (1), skal disse opplysningene registreres nøyaktig. Det anbefales at en delprøve av fiskebestanden veies før forsøket, slik at gjennomsnittsvekten kan anslås. 1.8.2.4. Belastning Det benyttes et høyt forhold mellom vann og fisk, slik at reduksjonen i Cw som følge av tilførsel av fisk ved begynnelsen av forsøket minimeres, og det unngås at konsentrasjonen av oppløst oksygen faller. Det er viktig at belastningen tilpasses den benyttede fiskearten. I alle fall anbefales en belastning på 0,1 til 1,0 gram fisk (våtvekt) per liter vann per dag. Belastningen kan økes dersom det påvises at den nødvendige konsentrasjonen av forsøksstoff kan opprettholdes innenfor ± 20 %, og at konsentrasjonen av oppløst oksygen ikke faller under 60 % metning. Ved valg av passende belastning skal det tas hensyn til fiskeartens normale habitat. For eksempel kan bunnfisk kreve et større bunnområde i akvariet for samme vannmengde enn pelagiske fiskearter. 1.8.2.5. Fôring Under akklimatiseringen og forsøket fôres fiskene med passende fôr med kjent lipid- og proteininnhold, i en mengde som er tilstrekkelig til å holde dem sunne og bevare kroppsvekten. Fiskene fôres daglig under akklimatiseringen og forsøket med en mengde som tilsvarer 1-2 % av kroppsvekten per dag; på denne måten holdes lipidinnholdet i de fleste fiskearter på et relativt konstant nivå under forsøket. Fôrmengden beregnes på nytt, for eksempel én gang i uken, slik at kroppsvekten og lipidinnholdet holdes konstant. Ved denne beregningen kan vekten av fisken i hvert forsøkskammer anslås ut fra kroppsvekten til den fisken som det sist er tatt prøver av i dette kammeret. De øvrige fiskene i kammeret veies ikke. Fôr som ikke er spist og ekskrementer suges opp daglig fra forsøkskamrene like etter fôringen (30 minutter til en time). Kamrene holdes så rene som mulig under hele forsøket, slik at konsentrasjonen av organisk materiale holdes så lav som mulig, siden forekomst av organisk karbon kan begrense biotilgjengeligheten til forsøksstoffet (1). Siden mange fôrtyper framstilles av fiskemel, må fôret analyseres for forsøksstoffet. Det er også ønskelig å analysere fôret for plantevernmidler og tungmetaller. 1.8.2.6. Lys og temperatur Lysperioden er vanligvis 12 til 16 timer, og temperaturen (± 2 ?C) må være tilpasset forsøksarten (se vedlegg 2). Type og art av belysning skal være kjent. Det bør tas hensyn til muligheten for fotolyse av forsøkssstoffet ved belysningsvilkårene i forsøket. Riktig belysning brukes for å unngå at fisken eksponeres for unaturlige fotokjemiske omdanningsprodukter. I noen tilfeller kan det være hensiktsmessig å bruke et filter til å blende ut UV-stråler under 290 nm. 1.8.2.7. Forsøkskonsentrasjoner Fiskene eksponeres under gjennomstrømningen for minst to konsentrasjoner av forsøkssstoffet i vann. Normalt velges den høyere (eller høyeste) konsentrasjonen av forsøksstoffet til ca. 1 % av akutt asymptotisk LC50 og minst ti ganger så høy som påvisningsgrensen i vann ved den anvendte analysemetoden. Den høyeste forsøkskonsentrasjonen kan også bestemmes ved å dividere den akutte 96-timers LC50 med et passende akutt/kronisk-forhold (for noen kjemiske stoffer vil et passende forhold være fra 3 til 100). Om mulig velges de(n) andre konsentrasjonen(e) slik at den skiller seg fra ovennevnte med en faktor på 10. Dersom det ikke er mulig på grunn av 1 % av LC50-kriteriet og påvisningsgrensen, kan en lavere faktor enn 10 benyttes, eller bruk av 14C-merket forsøksstoff kan vurderes. Det må ikke brukes en konsentrasjon som er over løsningsevnen til forsøksstoffet. Dersom det benyttes et oppløsende stoff, må konsentrasjonen ikke være over 0,1 ml/l, og den må være den samme i alle forsøksbeholderne. Stoffets bidrag og bidraget fra forsøksstoffet til totalt organisk karbon i forsøksvannet skal være kjent. Bruk av slike materialer bør imidlertid så langt det er mulig unngås. 1.8.2.8. Kontroller Det skal i tillegg til forsøksserien utføres én kontroll med fortynningsvann eller, dersom det er relevant, en kontroll med et oppløsende stoff, forutsatt at det er fastslått at det oppløsende stoffet ikke har noen virkninger på fisken. I motsatt fall skal begge kontrollene utføres. 1.8.3. Hyppighet for måling av vannkvalitet Under forsøket måles oppløst oksygen, TOC, pH og temperatur i alle beholdere. Samlet hardhet og eventuelt saltinnhold skal måles i kontrolløsningene og i en beholder med den høyere (eller høyeste) konsentrasjonen. Som et minstemål skal oppløst oksygen og eventuelt saltinnhold måles tre ganger - ved begynnelsen, rundt midten og ved avslutningen av opptaksperioden - og en gang i uken under utskillingsperioden. TOC måles ved begynnelsen av forsøket (24 timer og 48 timer før begynnelsen av opptaksfasen) før fisken tilsettes, og minst en gang i uken under opptaks- og utskillingsfasen. Temperaturen skal måles hver dag, pH ved begynnelsen og avslutningen av hver periode og hardheten én gang ved hvert forsøk. Temperaturen bør fortrinnsvis måles kontinuerlig i minst én beholder. 1.8.4. Prøvetaking og analyse av fisk og vann 1.8.4.1. Prøvetakingsplan for fisk og vann Det tas prøver av vann fra forsøkskamrene for bestemmelse av konsentrasjonen av forsøksstoffet før fisken has i, og under både opptaksfasen og utskillingsfasen. Som et minstemål skal det tas prøver av vannet samtidig med at fisken has i, og før fôring. Under opptaksfasen bestemmes konsentrasjonene av forsøksstoffet, slik at oppfyllelsen av gyldighetskriteriene kan kontrolleres. Det tas prøver av fisken minst fem ganger under opptaksfasen og minst fire ganger under utskillingsfasen. Siden det enkelte ganger vil være vanskelig å gjøre et rimelig presist overslag for BCF-verdien ut fra dette antallet prøver, særlig dersom utskillingen ikke følger førsteordens kinetikk, kan det være tilrådelig å ta prøver oftere i begge fasene (se vedlegg 4). Ekstraprøvene lagres og analyseres bare dersom resultatene fra første analyseserie viser seg å være utilstrekkelige for beregning av BCF med ønsket nøyaktighet. Et eksempel på en akseptabel prøvetakingsplan er gitt i vedlegg 4. Andre planer kan lett utarbeides ut fra andre anslåtte verdier av Pow for å beregne eksponeringstiden for 95 % opptak. Prøvetakingen fortsetter under opptaksfasen til likevekt nås, men høyst i 28 dager. Dersom likevekt ikke er nådd i løpet av 28 dager, fortsetter prøvetakingen til likevekt oppnås eller i høyst 60 dager. Før utskillingsfasen overføres fisken til rene beholdere. 1.8.4.2. Prøvetaking og tilberedning av prøvene Vannprøver for analyse tas for eksempel ved oppsuging gjennom rør av et inert materiale fra et sted midt i forsøkskammeret. Siden verken filtrering eller sentrifugering ser ut til å atskille den ikke-biotilgjengelige fraksjonen av forsøksstoffet fra den biotilgjengelige fraksjonen (særlig for superlipofile kjemikalier, dvs. med log Pow > 5) (1) (5) i alle tilfeller, er det ikke nødvendig å utsette prøvene for denne behandlingen. I stedet bør det sørges for at beholderne holdes så rene som mulig, og at innholdet av totalt organisk karbon overvåkes under både opptaksfasen og utskillingsfasen. Det tas ut et passende antall fisk (normalt minst fire) fra forsøkskamrene ved hver prøvetaking. Disse fiskene skylles raskt i vann, tørkes med absorberende papir og avlives umiddelbart på en human måte; deretter veies de. Fiskeprøver og vannprøver bør fortrinnsvis analyseres umiddelbart etter prøvetaking, slik at nedbryting eller andre tap unngås og det under resten av forsøket løpende kan beregnes tilnærmede opptaks- og utskillingshastigheter. Ved umiddelbar analyse unngås også forsinkelser i bestemmelsen dersom et platå er nådd. Dersom analysen ikke utføres umiddelbart, lagres prøvene på en hensiktsmessig måte. Før undersøkelsen begynner, innhentes opplysninger om riktig lagring for det bestemte forsøksstoffet, for eksempel dypfrysing, oppbevaring ved 4 ?C, lagringens varighet, ekstraksjon osv. 1.8.4.3. Analysemetodens kvalitet Siden hele framgangsmåten i det vesentlige avhenger av påliteligheten, nøyaktigheten og følsomheten til analysemetoden som benyttes for forsøksstoffet, må det kontrolleres eksperimentelt at nøyaktigheten og reproduserbarheten til den kjemiske analysen og gjenfinningen av forsøksstoffet i vann og fisk er tilfredsstillende for den bestemte metoden. Det må også kontrolleres at forsøksstoffet ikke kan påvises i det anvendte fortynningsvannet. Om nødvendig korrigeres verdiene for Cw og Cf som oppnås i forsøket, for gjenfinnings- og bakgrunnsverdiene fra kontrollgruppene. Fiske- og vannprøver håndteres gjennom hele forsøket på en slik måte at forurensning og tap (for eksempel som følge av adsorpsjon i prøvetakingsutstyret) minimeres. 1.8.4.4. Analyse av fiskeprøver Dersom radioaktivt merkede materialer benyttes i forsøket, er det mulig å analysere for samlet mengde radioaktivt merket materiale (dvs. det opprinnelige stoffet og metabolitter), eller prøvene kan renses slik at den opprinnelige forbindelsen kan analyseres separat. Dessuten kan de viktigste metabolittene karakteriseres ved likevektstilstanden eller ved avslutningen av opptaksfasen - alt etter hva som kommer først. Dersom BCF i form av samlede radioaktive rester er ? 1 000 %, kan det være tilrådelig, og for visse kategorier av kjemikalier, som plantevernmidler, sterkt anbefalelsesverdig å identifisere og kvantifisere nedbrytingsprodukter som utgjør ? 10 % av samlede rester i fiskevev ved likevekt. Dersom nedbrytingsproduktene som utgjør ? 10 % av samlede radioaktive rester i fiskevevet, er identifisert og kvantifisert, anbefales det at nedbrytingsproduktene i forsøksvannet også identifiseres og kvantifiseres. Konsentrasjonen av forsøksstoffet bør vanligvis også bestemmes for hver enkelt fisk som veies. Dersom det ikke er mulig, kan prøvene grupperes ved hver prøvetaking, men grupperingen begrenser mulighetene for statistisk behandling av dataene. Dersom en bestemt statistisk metode og nøyaktighet er viktige hensyn, må forsøket omfatte tilstrekkelig mange fisker til at den ønskede grupperingsmetode og statistiske nøyaktighet oppnås (6) (7). BCF uttrykkes både som funksjon av samlet våtvekt, og for sterkt lipofile stoffer, som funksjon av lipidinnholdet. Lipidinnholdet i fisk bestemmes om mulig ved hver prøvetaking. Det må benyttes egnede metoder for bestemmelse av lipidinnholdet (henvisning 8 og 2 i vedlegg 3). Ekstraksjon med kloroform/metanol kan anbefales som standardmetode (9). De forskjellige metodene gir ikke identiske verdier (10), så det er viktig å gi nærmere opplysninger om metoden som benyttes. Om mulig skal lipidanalysen utføres på samme ekstrakt som er benyttet til analyse av forsøksstoffet, siden lipidene ofte må fjernes fra ekstraktet før det kan analyseres kromatografisk. Forskjellen mellom lipidinnholdet i fiskene (i mg/kg våtvekt) ved slutten av forsøket og begynnelsen av forsøket skal ikke være større enn ± 25 %. Også vevets tørrstoffinnhold skal angis, slik at lipidkonsentrasjonen kan omregnes mellom våtvekt og tørrvekt. 2. DATA 2.1. Behandling av resultatene Opptakskurven for forsøksstoffet framkommer ved å sette av konsentrasjonen i/på fisker (eller bestemte vev fra dem) i opptaksfasen i forhold til tid, på aritmetiske akser. Dersom kurven har nådd et platå, dvs. blitt tilnærmet asymptotisk med tidsaksen, beregnes likevektstilstanden BCFSS ut fra følgende ligning: Cf som likevekt (gjennomsnittsverdi) / Cw som likevekt (gjennomsnittsverdi) Dersom likevekt ikke nås, er det mulig å beregne BCFSS med tilstrekkelig nøyaktighet for risikovurdering ut fra en "likevekt" ved 80 % (1,6/k2) eller 95 % (3,0/k2) av likevekten. Dessuten bestemmes konsentrasjonsfaktoren (BCFk) som forholdet k1/k2, de to førsteordens kinetiske konstantene. Hastighetskonstanten for utskilling (k2) bestemmes vanligvis ut fra utskillingskurven (dvs. avmerking av senkningen i konsentrasjonen av forsøksstoffet i fiskene i forhold til tid). Hastighetskonstanten for opptak (k1) beregnes deretter ut fra k2 og en verdi av C1 som utledes fra opptakskurven (se også vedlegg 5). Den foretrukne metoden for utledning av BCFk og hastighetskonstantene er å bruke ikke-lineære parameteroverslag på en datamaskin (11). Ellers kan grafiske metoder benyttes til å beregne k1 og k2. Dersom utskillingskurven åpenbart ikke er av første orden, må mer komplekse modeller benyttes (se henvisninger i vedlegg 3), og det bør søkes råd fra en biostatistiker. 2.2. Tolking av resultatene Resultatene bør tolkes med forsiktighet når de målte konsentrasjonene av forsøksløsningene holder nivåer som er nær analysemetodens påvisningsgrense. Klart definerte opptaks- og utskillingskurver er tegn på bioakkumuleringsdata av god kvalitet. Variasjonen i opptaks-/utskillingskonstanter mellom de to forsøkskonsentrasjonene bør være mindre enn 20 %. Observerte forskjeller av betydning i opptaks-/utskillingshastighetene mellom de to forsøkskonsentrasjonene bør registreres og mulige forklaringer gis. Vanligvis er sannsynlighetsgrensen for BCF fra velberegnede forsøk i nærheten av ± 20 %. 3. FORSØKSRAPPORT Forsøksrapporten skal inneholde følgende opplysninger: 3.1. Forsøksstoff - fysisk tilstand, og om relevant, fysisk-kjemiske egenskaper, - data om kjemisk identitet (herunder innhold av organisk karbon dersom det er relevant), - dersom forsøksstoffet er radioaktivt merket: det/de merkede atomets/atomenes nøyaktige plassering og prosentdelen av radioaktivitet forbundet med urenheter. 3.2. Forsøksarter - vitenskapelig navn, stamme, kilde, eventuell forhåndsbehandling, akklimatisering, alder, størrelsesintervall osv. 3.3. Forsøksvilkår - Framgangsmåte benyttet ved forsøket (f.eks. gjennomstrømning eller semi-statisk), - type og art av belysning som er benyttes, og lysperiode(r), - forsøkets utforming (f.eks. forsøkskamrenes antall og størrelse, utskiftingshastigheten for vannmengde, antall delprøver og fisk per delprøve, antall konsentrasjoner som er prøvd, opptaks- og utskillingsfasenes varighet, prøvetakingshyppighet for fiske- og vannprøver), - tilberedningsmetode for stamløsninger og fornyingshyppighet (løsemiddel, middelets konsentrasjon og bidrag til innhold av organisk karbon i forsøksvannet må oppgis dersom et slikt middel benyttes), - nominelle forsøkskonsentrasjoner, gjennomsnittlige måleverdier og deres standardavvik i forsøksbeholderne samt metoden som ble benyttet for å beregne dem, - kilden til fortynningsvannet, beskrivelse av eventuell forbehandling, resultater av en eventuell påvisning av de benyttede fiskenes evne til å overleve i vannet, og vannets egenskaper: pH, hardhet, temperatur, konsentrasjon av oppløst oksygen, restklor (dersom det er målt), totalt organisk karbon, suspenderte faste stoffer, mediets saltinnhold (om relevant) og eventuelle andre målinger, - vannkvaliteten i forsøksbeholderne, pH, hardhet, TOC, temperatur og konsentrasjon av oppløst oksygen, - detaljerte opplysninger om fôring (for eksempel typen fôr, kilde, sammensetning - ihvertfall lipid- og proteininnhold om mulig, mengde gitt og hyppighet), - opplysninger om behandlingen av fiskene og vannprøvene, herunder nærmere opplysninger om tilberedning, lagring, ekstraksjon og analysemetoder (og deres nøyaktighet) for forsøksstoffet og lipidinnholdet (dersom det er målt). 3.4. Resultater - resultater fra eventuelle innledende undersøkelser som er utført, - dødeligheten til kontrolliskene og fiskene i hvert eksponeringskammer samt eventuell observert unormal atferd, - lipidinnholdet i fiskene (dersom det er bestemt på forsøkstidspunktet), - kurver (herunder alle målte data) som viser opptak av og utskilling fra fiskene av det kjemiske stoffet som prøves, tiden til likevekt, - Cf og Cw (med standardavvik og måleområde dersom relevant) for alle prøvetakingstider (Cf uttrykkes i µg/g våtvekt (ppm) av hele kroppsvekten eller bestemte vev, f.eks. lipidvev, og Cw i µg/ml (ppm). Cw-verdier for kontrollserien (bakgrunnsdata rapporteres også)), - bioakkumuleringsfaktoren ved likevekt (BCFSS) og/eller kinetisk konsentrasjonsfaktor (BCFk), og dersom relevant, 95 % sannsynlighetsgrenser for hastighetskonstantene for opptak og utskilling (tap) (alle uttrykt i forhold til hele kroppsvekten og det samlede lipidinnholdet, dersom det måles, til dyret eller bestemte vev fra det), sannsynlighetsgrenser og standardavvik (om tilgjengelig) og metoder for beregning/dataanalyse for hver konsentrasjon av forsøksstoffet som benyttes, - dersom radioaktivt merkede stoffer benyttes, og dersom det er nødvendig, kan akkumulering av eventuelle påviste metabolitter angis, - alt uvanlig ved forsøket, alle avvik fra disse framgangsmåtene og alle andre relevante opplysninger. Reduser i størst mulig grad resultater som "ikke påvist ved påvisningsgrensen" ved utviklingen av forsøksmetoden og forsøksutformingen, siden resultatene ikke kan brukes til beregning av hastighetskonstantene. 4. HENVISNINGER (1) Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistant chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156. (2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390. (3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals No. 3. (4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Danmark. (5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994. (6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. (7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N. C. 27711. (8) Compaan H. (1980) in 'The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation', Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, Haag, Nederland. (9) Gardner et al (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105. (10) Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp. 1431-1436. (11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method-Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. (12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs. Vedlegg 1 Kjemiske kjennetegn ved egnet fortynningsvann Stoff Konsentrasjonsgrense 1 Partikler 5 mg/l 2 Totalt organisk karbon 2 mg/l 3 Ikke-ionisert ammoniakk 1 µg/l 4 Restklor 10 µg/l 5 Totalt innhold av organiske fosforholdige plantevernmidler 50 ng/l 6 Totalt innhold av organiske klorholdige plantevernmidler pluss polyklorerte bifenyler 50 ng/l 7 Totalt organisk klor 25 ng/l 8 Aluminium 1 µg/l 9 Arsen 1 µg/l 10 Krom 1 µg/l 11 Kobolt 1 µg/l 12 Kopper 1 µg/l 13 Jern 1 µg/l 14 Bly 1 µg/l 15 Nikkel 1 µg/l 16 Sink 1 µg/l 17 Kadmium 100 ng/l 18 Kvikksølv 100 ng/l 19 Sølv 100 ng/l Vedlegg 2 Anbefalte forsøksfiskarter Anbefalt art Anbefalt forsøkstemperatur-intervall (?C) Anbefalt samlet lengde for dyr som benyttes (cm) 1 Danio rerio(1) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) zebrafisk 20-25 3,0 ± 0,5 2 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) ørekyte 20-25 5,0 ± 2,0 3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) karpe 20-25 5,0 ± 3,0 4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck og Schlegel) japansk risfisk 20-25 4,0 ± 1,0 5 Poccilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) guppy 20-25 3,0 ± 1,0 6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) blågjellet solabbor 20-25 5,0 ± 2,0 7 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) regnbueørret 13-17 8,0 ± 4,0 8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) trepigget stingsild 18-20 3,0 ± 1,0 (1) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231. Forskjellige brakkvanns- og saltvannsarter er blitt brukt i forskjellig land, for eksempel: Ørnefisk av arten Leiostomus xanthurus Leiostomus xanthurus Havkaruss Cyprinodon variegatus Stripefisk Menidia beryllina "Shiner perch" Cymatogaster aggregata Tunge Parophrys vertulus Ulke Leptocottus armatus Trepigget stingsild Gasterosteus aculeatus Havabbor Dicentracus labrax Laue Alburnus alburnus Innsamling Ferskvannsfiskene i tabellen er lette å ale opp og/eller er lett tilgjengelige hele året, mens tilgjengeligheten til saltvanns- og brakkvannsarter delvis er begrenset til deres respektive land. De kan oppdrettes og holdes i oppdrettsanlegg eller laboratorium, under vilkår der sykdom og parasitter holdes under kontroll, slik at forsøksdyret er friskt og av kjent avstamning. Disse fiskene er tilgjengelige i store deler av verden. Vedlegg 3 Forutsigelse av opptaksfasens og utskillingsfasens varighet 1. Forutsigelse av opptaksfasens varighet Før forsøket utføres, kan et overslag over k2 og dermed en prosentdel av tiden som trengs for å nå likevektstilstanden, utledes fra empiriske forhold mellom k2 og fordelingskoeffisienten n-oktanol/vann (Pow) eller k2 og vannløseligheten (s). For eksempel kan et overslag over k2 (dag-1) utledes fra følgende empiriske forhold (1): log10 k2 = -0,414 log10 (Pow) + 1,47 (r2 = 0,95) (ligning 1) Andre forhold er beskrevet i henvisning 2. Dersom fordelingskoeffisienten (Pow) ikke er kjent, kan det gjøres et overslag (3) ut fra kunnskap om stoffets vannløselighet (s) etter følgende uttrykk: log10 (Pow) = 0,862 log10 (s) + 0,710 (r2 = 0,994)(ligning 2) der s = løselighet (mol/l): (n = 36). Disse forholdene gjelder bare for kjemikalier med log Pow-verdier mellom 2 og 6,5 (4). Tiden det tar å nå en bestemt prosentdel av likevekt kan utledes av den generelle kinetikkligningen som beskriver opptak og utskilling (førsteordens kinetikk) ved hjelp av k2-overslaget: eller dersom Cw er konstant: (ligning 3) Dersom det nærmer seg likevekt (t ? ?), kan ligning 3 reduseres (5) (6) til: Da er k1/k2 ? Cw en tilnærming til konsentrasjonen i fiskene ved "likevekt" (Cf,s). Ligning 3 kan omskrives til: (ligning 4). Ved bruk av ligning 4 kan den tid det tar å nå en viss prosentdel av likevekt, forutsis når det er gjort et overslag over k2 ved hjelp av ligning 1 eller 2. Som rettesnor gjelder at den statistisk optimale lengden av opptaksfasen for utarbeiding av statistisk akseptable data (BCFk) er det tidsrom som kreves for at kurven til logaritmen til konsentrasjonen av forsøksstoffet i fiskene satt av mot lineær tid skal nå sitt midtpunkt, eller 1,6/k2, eller 80 % av likevekt, men ikke mer enn 3,0/k2 eller 95 % av likevekt (7). Den tid det tar å nå 80 % likevekt er (ligning 4): (ligning 5). Tilsvarende for 95 % likevekt er: (ligning 6). For eksempel vil opptaksfasens varighet (up) for et forsøksstoff med log Pow = 4 være (med ligning 1, 5 og 6): log10 k2 = -0,414 ? (4) + 1,47 k2 = 0,652 dager-1 up (80 %) = 1,6/0,652, dvs. 2,45 dager (59 timer) eller up (95 %) = 3,0/0,652, dvs. 4,60 dager (110 timer) Tilsvarende vil opptaksfasens varighet for et forsøksstoff med S = 10-5 mol/l (log s = 5,0) være (med ligning 1, 2, 5 og 6): log10 (Pow) = -0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02 log10 k2 = -0,414 (5,02) + 1,47 k2 = 0,246 dager-1 up (80 %) = 1,6/0,246, dvs. 6,5 dager (156 timer) eller up (95 %) = 3,0/0,246, dvs. 12,2 dager (293 timer). Alternativt kan uttrykket teq = 6,54 ? 10-3 Pow + 55,31 (timer) brukes til å beregne den tid det tar å oppnå effektiv likevekt (4). 2. Forutsigelse av utskillingsfasens varighet Den tid som er nødvendig for at kroppsbelastningen skal falle til en viss prosentdel av utgangskonsentrasjonen, kan også forutsies ut fra den generelle ligningen som beskriver opptak og utskilling (førsteordens kinetikk) (1) (8). For utskillingsfasen anslås Cw å være null. Ligningen kan da reduseres til: der Cf,0 er konsentrasjonen ved begynnelsen av utskillingsperioden. En utskilling på 50 % vil da nås på tidspunktet (t50): Tilsvarende vil 95 % utskilling nås ved: Dersom 80 % opptak benyttes i første periode (1,6/k2) og 95 % tap benyttes i utskillingsperioden (3,0/k2), blir utskillingsfasen omtrent dobbelt så lang som opptaksfasen. Det er imidlertid viktig å merke seg at overslagene er basert på antakelsen om at opptaks- og utskillingsmønstrene følger førsteordens kinetikk. Dersom det åpenbart ikke dreier seg om førsteordens kinetikk, må mer komplekse modeller benyttes (f.eks. henvisning (1)). Litteratur (for vedlegg 3) (1) Spacie A. and Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309-320. (2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute. (3) Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compunds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10. (4) Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707. (5) Branson D. R., Blau G. E., Alexander H. C. and Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792. (6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic Organisms, in: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4.4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley and Sons Ltd. N.Y. (7) Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R. and Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622. (8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3-19. Vedlegg 4 Teoretisk eksempel på prøvetakingsplan for bioakkumuleringsforsøk med stoffer med log Pow = 4 Prøvetaking av fisk Tidsplan for prøvetaking Antall vannprøver Antall fisker per prøve Minste påkrevde hyppighet (dager) Tilleggsprøvetaking Opptaksfasen -1 0 2 (*) 2 Tilfør 45-80 fisker 1. 0,3 0,4 2 (2) 4 (4) 2. 0,6 0,9 2 (2) 4 (4) 3. 1,2 1,7 2 (2) 4 (4) 4. 2,4 3,3 2 (2) 4 (4) 5. 4,7 2 6 Utskillingsfasen Overfør fiskene til vann som ikke inneholder forsøksstoff 6. 5,0 5,3 4 (4) 7. 5,9 7,0 4 (4) 8. 9,3 11,2 4 (4) 9. 14,0 17,5 6 (4) (*) Det tas vannprøve etter minst tre kammervolumer vann. Verdier i parentes er antall prøver (vann, fisk) som skal tas dersom tilleggsprøvetaking utføres. NB: Før forsøket anslås k2 for log Pow på 4,0 å være 0,652 dager-1. Forsøkets samlede varighet settes til 3 ? up = 3 ? 4,6 dager, dvs. 14 dager. For overslaget av "up" vises det til vedlegg 3. Vedlegg 5 Modellvalg De fleste bioakkumuleringsdata antas å kunne beskrives "rimelig" godt ved en enkel modell med to deler/to parametrer, slik det er angitt ved den rettlinjede kurven gjennom punktene for konsentrasjoner i fisk under utskillingsfasen, når de avtegnes på semilogaritmisk papir. (Dersom disse punktene ikke kan beskrives ved en rettlinjet kurve, må mer komplekse modeller benyttes; se f.eks. Spacie and Hamelink, henvisning 1 i vedlegg 3). Grafisk metode for bestemmelse av hastighetskonstanten for utskilling, k2 Sett av konsentrasjonen av forsøksstoffet som er funnet i hver prøve av fisk mot prøvetakingstiden på semilogaritmisk papir. Linjen har helningen k2. Merk at avvik fra den rette linjen kan tyde på at utskillingens kinetikk er mer kompleks enn første orden. Det kan benyttes en grafisk metode for å løse utskillingstyper som ikke har førsteordens kinetikk. Grafisk metode for bestemmelse av hastighetskonstanten for opptak, k1 På grunnlag av k2 beregnes k1 som følger: (ligning 1). Verdien av Cf avleses fra midtpunktet på den glatte opptakskurven som framkommer når logaritmen til konsentrasjonen settes av mot tiden (på en aritmetisk skala). Edb-basert metode for beregning av hastighetskonstantene for opptak og utskilling Den foretrukne måte å beregne biokonsentrasjonsfaktoren og hastighetskonstantene k1 og k2 på, er ved bruk av ikke-lineære parameteroverslag på en datamaskin. Disse programmene finner verdier for k1 og k2 ut fra et sett med sekvensielle tidskonsentrasjoner og følgende modell: (ligning 2) (ligning 3) der tc = tiden ved avslutningen av opptaksfasen. Denne framgangsmåten gir overslag over standardavvikene for k1 og k2. Siden k2 i de fleste tilfeller kan utledes fra utskillingskurven med relativt stor nøyaktighet, og siden det er sterk korrelasjon mellom de to parametrene k1 og k2 dersom de beregnes samtidig, kan det være tilrådelig først å beregne k2 ut fra utskillingsdataene alene og deretter beregne k1 ut fra opptaksdataene ved hjelp av ikke-lineær regresjon. 1) EFT 196 av 16.8.1967, s. 1. 2) EFT L 343 av 13.12.1997, s. 19. 19.6.åååå 398L0073.JTE 19.6.åååå 398L0073.JTE 19.6.åååå 398L0073.JTE