PCR-basert identifikasjon av tre torskearter.

ld..oG-

tas

Prosjektoppgave ved Høgskolen i Bodø

Av Reidun Dahl

---

Forord

Denne oppgave inngår som en 4 vekttallsoppgave i påbygningsstudiet KvaIitetsledelse og

Foredling av marint råstoff ved HØgskolen i bod^.

Høgskoledosent Cristel Solberg takkes for god stØtte og veiledning ved skriving av oppgaven.

De ansvarlige for båten Ocar Sund takkes for bruken til innsamling av kolmu1eprØvene.

Videre takkes Dr. scient Iciar Martinez og Fiskeriforskning AS i Troms0 for bruk av utstyr

og kjemikalier ved gjennomføring av forsøkene og god veiledning under arbeidsperioden.

Iciar Martinez takkes også for innsamling av torsk- og hyseprøvene som ble brukt til forsøket.

Prosjektleder Nina Str~msvik,

avdelling for medisinsk genetikk ved Haukeland sykehus

takkes for at jeg

fikk

lov til

å

bruke deres bilder i min oppgave.

--.

dt

i.

rtc~.

,

Li-)i.

L

L

~

  

Reidun Dahl

---

INNHOLD

SAMMENDRAG

...........................................................................................................

4

INTRODUKSJON

..........................................................................................................

5

2.1 Betydning av riktig produktmerking

......................................................................

5

......................................................

2.2

Bruk av molekylær metode for spesifikasjon

6

2.3

NØdvendigheten av prosjektet

...............................................................................

7

.........................................................................................

MATERIAL OG METODER

8

......................................................................

3.1

Fisk; arter. vev og varmebehandling

8

..........................................................................................

3.2

Tilberedning av prØver

X

3.3

DNA ekstraksjon

...................................................................................................

9

3.3.1 Elektoferese for estimering av DNA

............................................................

9

...........................................................................................

3.4

RAPD fingerprinting

12

...............................................

...................

3.4.1 Blanding og PCR program

..

12

..........................................................

3.5

Cytokrom b sekvens: PCB-SSCP analyse

15

.........................................................................

3.5.1 Blanding og PCR program

15

3.5.2 Tilberedning av prØver til elektroferese

....................................................

15

..............................................................................................

3.5.3 Elektroferese

16

............................................................................

3.5.4 Prosedyre for gelt~rking:

17

DISKUSJON

................................................................................................................

21

............................................................................................................

KONKLUSJON

22

...................................................................................................................

VEDLEGG

23

REFERANSER

.............................................................................................................

29

---

1

SAMMENDRAG

Lovgivningen i Norge og i land som er relevant til norsk handel (USA, Canada, EU) er stadig

mer

krevende når det gjelder korrekt merking og

spesifikasjon av sammensetningen,

næringsverdi

og

produktets sikkerhet. Merking av produkt som

er

tilgjengelig

for

konsumenten inkluderer råvarene som er

brukt i frernstillingsprosessen av

produktet.

Ettersom erstatning og forveksling (enten med vilje eller ved uhell) ikke uvanlig er det behov

for hurtig og sikker analytiske metoder som tillater et storre antall prØver for autentisering.

Identifikasjon av artene kan gj~res

ved bruk av teknikker basert på analyser av protein eller

DNA.

DNA

analyser

er

foretrukket

fordi

proteinene

er

vevsavhengige, mens

DNA

fragmentet er det samme for alt vev i hvert dyr. Også fordi etter behandling, som for eksempel

sterilisering, røyking etc, kan proteiner være uegnet til analyse, men det som er igjen av

DNA

fragmenter kan brukes til analyser.

For

å

tilfredsstille dette behovet, har dette arbeidet til hensikt

å

standardisere en molekylær

metode

for

artsidentifikasjon i produkter

som

er

tilgjengelig

for

konsumenter i tre

kommersielle interessante torskearter: torsk, hyse og kolmule.

Som analysemateriell har jeg brukt fiskemuskel som vev og fiskelever, RAPP "typing" som

teknikk og tre typer varmebehandling

-

kokt, stekt og autoklaverte prdver.

---

2

INTRODUKS

JON

2.1

Betydning av riktig produktmerking

Identifikasjon av kommersielt viktigc arter kan varre et problem når prosessen urnuligaør

gjenkjennelsen av råmaterialet. Dette er tilfellet for eksempel med fiskefilet, rognprodukter,

fiskepinner, hermetikk etc. Forveksling og erstatning av fiskearter foregår når arter som skulle

være i produktet er helt eller delvis erstattet av en lignende, vanligvis billigere

art.

I fiskematproduksjon forekommer erstatning når filet av beslektede arter er tilgjengelig og

det er betydelige prisforskjeller, mens det for «surimi» produkter, f.eks. scarnpi er erstatninger

mer vanlig.

Norge og land som er relevant til norsk handel vedtar lover for

å

sikre korrekt merking av

produkter. For

å

overholde lovene, er det viktig

å

etablere objektive metoder som kan

identifisere artene nøyaktig. Når det er nødvendig

å

identifisere eller bekrefte arten, for

eksempel for

å

kontrollere spesifikasjonen i en kommersiell kontrakt, for at den korrekte

import tariffen skal benyttes, eller

å

kontrollere at identiteten av artene er i samsvar med

produktmerkingen, er det nødvendig

å

ha en annen metode enn sensorisk for identifrkasjon.

I tillegg til det rettslige og økonomiske aspektet av korrekt merking, er det viktig for

konsumenten

å

ha denne informasjonen. Noen personer er allergisk for fisk eller reker. De vil

derfor unngå produkter som inneholder disse artene og kjøpe andre arter. Misvisende eller feil

merking kan derfor ha alvorlige konsekvenser for allergikere og for instansen som skal utØve

den kliniske behandlingen. I de tilfeller hvor konsumenten velger

å

forfølge produsenten av

det feilmerkede produktet, vil han måtte dokumentere at produktet faktisk inneholdt andre

arter enn de som det var merket med, eller produsenten vil måtte dokumentere at produktet

ikke inneholder arten.

Det etiske aspektet er

å

unngå bedrageri, feilmcrking av produktet og feilinformasjon til

forbruker.

---

2.2

Bruk av molekylær metode for spesifikasjon

Noen nyutviklede teknikker er basert på analyse av nukleinsyre, vanligvis mitokondriet eller

genomisk DNA. En klar fordel med alle disse teknikkene er at resultatet ikke er avhengig av

hvor vevet som skal analyseres er tatt fra, og det er heller ikke avhengig av alderen av

individet som prøvene er tatt i fra. Sekvensering av arts-spesifikke DNA fragmenter er den

sikreste men også den mest kostbare og tidkrevende teknikken. Disse har et stort potensiale,

men trenger forhåndskunnskap av den arts-spesifikke DNA-fragmentet og de som i dag

brukes kan gi falske positive som skyldes kryss-reaksjoner mellom nært beslektede arter.

På mange andre områder er polymerase kjedereaksjon (PCR) blitt brukt i produkt

spesifikasjon. For

å

oppdage og samtidig forsterke spesifikke sekvenser trenges det to korte

fragmenter

(

20-30 basepar) kalt «primers», hvilke sekvenser må være kjent. Det DNA-

30

40

fragmentet som befinner seg mellom disse to «primere» er vanligvis forsterket mellom 2 -2

ganger, og derfor trenger PCR veldig liten DNA mengde.

Man kan imidlertid være oppmerksom på at man trenger ikke

å

vite sekvensen av det

forsterkede fragmentet, dvs.- det fragmentet mellom de to «primers». Artsidentifikasjonen er

vanligvis gjort ved sammenligning av den dobble DNA strengen, eller størrelsen av

fragmentet som man fikk etter

å

ha behandlet PCR med restriksjonsensym med de samme i de

kjentc artene,

En alternativ YCR metode som vi har brukt for identifikasjon av noen produkter er basert på

bruken av sammc teknikk som brukes for

å

produsere arts-spesifikk genetisk fingerprint. I

dette tilfelle er det brukt bare en <<primer>,

og sekvensen er vilkårlig slik at det ikke er

nødvendig

å

vite noe som helst sekvcns under forseket. (Må ha primer 2 steder amplisering)

Denne spesielle bruken av teknikken kalIes «arbitarily primed poIymerase chain reaction»,

AP-PCR, eller RAPD (tilfeldig forsterking av polymorpic DNA). Det har blitt brukt til

å

lage

kopierbare fingerprints fra ulike organismer, inkludert fisk og fiskeprodukter uten nødvendig

forkunnskap til noen spesifikk DNA frekvens. Enhver «primer» DNA-kombinasjon vil

*

produsere et unikt mønster av forsterkede fragmenter eller "fingerprint". Noen av disse

fragmentene er polymorfiske, dvs. de er tilstede i noen individ men fravaerende i andre, og

kan brukes som genetisk identifikasjon for utvalgte genetiske forsøk og stammeidentifikasjon.

---

Andre «primer»

produseres ikke eller lite polymorfiske fragmenter og passer derfor bedre for

artsidentifikasjon. Artsidentifikasjon utføres ved sammenligning av "fingerprinter" av ukjente

med kjente arter.

2.3

N~dvendigheten

av prosjektet

Resultatene vil sikre sjømat prosesser, kontrollere byråer og forbruker organisasjoner, med en

metode for dokumentasjon av produktsammensetningen og påviser ungyaktig produktmerking

der det er brukt erstatning:Derfor

er det nyttige anvendelser for spesifikasjon i kommersiell

handelskontrakt, riktig innfØrt merking og deklarasjon av identitet pålitelighet av arter som

erklacrer påliteligheten av produktet.

Flere grupper vil ha nytte av resultatet av dette arbeidet. Første sjømat produsent

som mottar

rund fisk kan bruke dette fordi det dokumenterer kvalitetsegenskapen av det produktet de

leverer. For sj~matprodusenter

som mottar mange forskjellige produkter som ikke er lett

å

identifisere, for eksempel frossen blokk av fillet, vil det hjelpe

å

gjøre opp en riktig kontrakt

hvor en betaler en fast pris for de artene de i virkeligheten mottar, og også et dokument som

viser påliteligheten av deres siste produkt. Kontrollorganer og forbrukergrupper kan bruke det

til

å

fastsette passende pris på produktet og dermed unngå økonomisk bedrageri og samtidig

beskytte forbrukernes rettigheter.

---

3

MATERIAL OG METODER

3.1

Innsamling av prøver:

Kolmule (Micromesistius poutassoz~)

fanget på trål på 380 m dyp i Saltenfjorden og torsk

(Gadus morhun) og hyse (Melanogrammus negleJnus) fanget på trål i Malangen ble brukt.

Fra hver fisk, ble prøver av, muskel og lever så snart som mulig etter død overført til en liten

beholder med 96

%

etanol, i et forhold omtrent 3:1 (etano1:prøve). Hver prøve ble korrekt

merket slik at en kan gå tilbake og identifisere arten, nummer, kjønn lengde og vekt av fisken,

dato og posisjon av fangststed. Beholderne holdes godt lukket for

å

hindre fordamping av

etanol og oppbevart på fryserom før opparbeiding av DNA. Under opparbeiding av DNA

oppbevares beholderne på kjølerom.

Resten av fisken ble raskt merket, pakket i plastpose og aluminiumsfolie og frosset ved ca.

-20°C for senere bruk til fremstilling av behandlede produkter. Etter tining ble en liten bit

vev av hver fisk skåret ut og nummerert og brukt til fremstilling av kokte, stekte og

autoklaverte prøver.

3.2

Tilberedning av prØver

Det ble tatt ut 8 fisk for hver behandling og av hver fisk ble en muskelprøve og en leverprøve

unders~kt.

4 typer behandling ble undersøkt. Størrelse på prøvene var ca 4 x 4 x 4 cm og de ble

oppbevart i etanol. Kokte prøver ble dampkokt i aluminiumsfolie i begerglass i

5

minutter.

Stekte prøver ble stekt i aluminiumsform i soyaolje i 4 minutter på hver side. Autoklaverte

prøver ble autoklavert i begerglass med aluminiumsfolie på toppen. Autoklavenngstiden var

20 minutter ved 12

1°C.

---

3.3

DNA ekstraksjon

50 mg av hver muskel- og leverprøver som var kokt, stekt eller autokiavert ble veid i

eppendorfrør (2,2 ml) og klippet godt opp med en spiss saks.

400 yl salt lysis buffer, etterfulgt av 10 p1 20

%

SDS og 10 y1 av 200rng/ml protease K

tilsettes. Protease K løser opp proteinene i celleveggen slik at celleinnholdet blandes i

bufferlgsningen. DNA tråden blir «fri».

Hvis ikke all muskel er løses opp tilsettes nye 10 y1 av 200 mg/ml Protease K, som

har

max.

aktivitet ved 60°C.

Inkuberte provene på vippebrett over natten i romtemperatur, men etter 2,5 rime på

vippebrettet ble nye 10 yl Protenase K tilsatt for

å

få oppløst all fiskemuskelen.

For

å

felle ut proteinene tilsettes 200 yl 6 M NaCl. Sentrifugeres ved 1500 rpm i 30 minutter.

Supernatanten overføres til nye eppendorfrør og tilsettes 1,250 ml isopropanol for

å

utfelle

DNA.

Provene kj~les

i -20°C i 1 time og sentrifugeres ved 15000 rpm i 30 min.

Pelleten (bunnfallet) ble vasket med 500 yl 70

%

etanol, sentrifugert i nye 30 minutter.

Supernatanten helles ut og resten av 70

%

etanol fjernes ved

å

la bunnfallet tØrke i romtemp.

For

å

løse opp DNA tilsettes 200 pl 50 mM Tris-HCl,

pH

8,O

og preven varmes opp ved

5.5'~

i 30 minutter.

Den klare supernatanten brukes videre.

3.3.1

ELcktofcrcse for cstimcring

av

DNA

Prinsipp

Agarose gel elektroferese benyttes for

å

separere ulike DNA fragmenter som man får ved

DNA ekstraksjon, PCR eller restriksjonsenzymkutting. Gelen kjøres i et elektroferesekar,

med

buffer. Negativt laddet DNA vil vandre mot positiv pol. Det er viktig at buffer i gel og ka.

har

samme styrke.

Hastighet av segresjonen avhenger av flere ting: Storrelse på DNA fragment, om der er

lineært, sirkulært eller supercoil, agarosekonsentrasjonen i gelen og strømstyrke (volt,

mA).

---

Kvalitet

OP

mengde

2% agaroserrel20x20 cm

1,25g Nusieve

+

3,75 g Seaken Le agarose til 250 ml med 0,SxTBE buffer blandes i en E-

kolbe og oppvarmes i mikrobølgeovn i ca 4 minutter

(

til alt er oppløst). Avkjøles under kaldt

vann til løsningen er ca. 370C og støpes i «gel formen*. Det er viktig

å

unngå luftbobler i

gelen.

Tre fortynninger brukes for elektroferese til hver gel:

ng lamba

50

100

200

ul lamba standard

6

12

24

pl

H20

24

18

6

farge

15

15

15

Til elektroforesen brukes:

14 p1 av hver lamba fortynning ble først satt på gelen.

Deretter tilsettes 10 p1 prøvevolurn og

5

yl farge og gelen kjøres ved 4,4 v/cm i ca 1 time.

Til slutt farges gelen 20 minutter i en løsning bestående av 2100 ml

0,5x TBE buffer og 110 hl Ethidiumbrornid. Dette arbeidet må utf~res

forsiktig siden

ethidiumbrornid virker mutagent og representerer helsefare.

Ethidiumbromid fester seg til båndene pi gelen og DNA båndene kan observeres tydeligere

under uv-lys.

Til slutt vaskes gelen med

5x

TBE buffer. Dokumentering av ge1en gjøres ved fotografering i

ultrafiolett lys.

---

R eaksjom

sbilufi

&$mg

DNA

tenxplat

~målsekveaxi;)

-

Prlxx~ers

Cstartrekuens)

-

Nukleotidm

(tyggestenerha

zer)

-

Polyrnerase

<cmwmj

-

Bu~~w

&W,

salt,

co-Faktorer)

Figur 1. Viktige bestanddeler i cn PCR reaksjon

Denaturering

G5

fxa hverandre. bryte bindinger

Annealing

,

Smelte sammen.

hybndisere

Extention

.

Forlenge. syntese

-

Figur

2.

PCK

maskin,

programmerbare

varmeblokk, prinsipp, ord og uttrykk

Primer A

cn.20

bp

Figur 3.Må kunne lage primere

Hegrening i fragmentst~rrelsen

som vi ~mker

å

undersclke

---

3.4

RAPD fingerprinting

Tilfeldig forsterking av mangeformet (Polymorphic) DNA (RAPD) eller vilkårlig Arbitrarily

Primed Polymerase Chain reaksjon (AP-PCR) ble brukt for

å

frembringe fingerprint av

produktene. Fiskeriforskning har lykkes med denne teknikken i

å

identifisere arter og stammer

av

Listeria spp.;

Vibrio;

marine pattedyr; Atlantisk laks

(Snlrno salar);

Aeromnas

(upublisert), reker (Pandalus borealis) og bearbeidede produkter, sild og arktisk charr

(Scrlvelintls

nlpinus).

I disse tilfellene blir resultatene synliggjort med ethydium brornid farget

DNA fragment bestemt i 2% agarose gel.

Prinsipp

Polymerase Chain Reaction (PCR) er i dag en av de mest benyttede metoder innen medisinske

og biologiske kretser. Teknikken er som navnet indikerer en kjedereaksjon som ved hjelp av

spesifikke primer gjør det mulig og

å

amplifisere en Ønsket DNA sekvens. Dette betyr at men

trenger veldig lite templat DNA som utgangspunkt for

å

utføre en analyse. Dette er av stor

betydning der tilgang på prøvemateriale er begrenset.

3.4.1

RAPD-fingerprinting.

Stock

løsning

Buffer

dNTP

Primers

WC12

S

toffel

---

Blanding (Mix)

0,4 uM primer

T-20

2 Units Enzym/prøve

p1

stock Sluttkonsentrasjon

H20

1045

Buffer

330

l x

dNTPs

3

3

0,l rnM

Primer

220

0,4 uM

MgCh

528

4

rnM

Stoffel

44

4 unitslrør

4-

10 ul

DNA

Prosedyre og program:

20 pl

av

blandingen og 10

p1

DNA tilsettes prøvebrettet. Deretter tilsettes 20 yl olje. Før det

hele settes i PCR maskinen strykes litt olje på undersiden av brettet. Dette gjøres for

å

få

bedre kontakt mellom brett og oppvanningsenhet.

PROGRAM

Trinn

Temperatur

1

>

94°C

2)

94°C

3)

35°C

4)

72°C

5)

Går til trinn 2

6)

72°C

7)

15°C

8)

Slutt

Tid

1 minutt

10 sekund

20 sekund

1 minutt

39 ganger

5

minutt

10 sekund

---

Når PCR maskinen er ferdig

:

Tilsett

5

p1

farge. (Blandes for tilsetting på gelen.)

15 pl av blandingen pippeteres ut i bronnnene på 2% agarosegel.

Elektroforese

kj~res

ved 250 volt i ca. 1,5 time.

Til slutt farges gclcn mcd buffcr og ethidiumbromcd. (bcskrcvct tidligcrc.)

Dokumentering av gelen ved fotografering i uv

-

lys

Figur 4. Oversikt over amplifiseringen

---

3.5

Cytokrorn b sekvens: PCB-SSCP analyse

Resultater av de tre par av «primer» som er beskrevet av Barlett og Davidson, Rehbein et. al.

og Unseld et. al. som gir henholdsvis produkter av 358 basepar, 148 basepar og 123 basepar

av rnitokondrie cytokrom b gen ble testet som metode, siden de allerede

har

vist seg brukbar

for denne type analyser.

Det dobbelt-strengede produkt. denatureres ved formamide og NaOH. De to enkie trådene

gj~res

synlig med s~lvfarging

etter elektroferese med 10% polyacrylamid gel som er i stand

til

å

påvise Single Strand Conformation Polyrnorphisms (SSCP).

3.5.1

Blanding

og PCR program

DNA denaturerings l~sning.

Lagres i romtemperatur. Brukes til elektroforese med

SDS

gel (12,5

%

exel gel.)

Lager 100

ml

av 10 mM NaOH

NaOH Mw 40

0,04 g NaOH l~ses

i 100 ml H20. Deretter tilsettes 95 g formamide, 0,05 g bromophenol blue

og til slutt 0,05 g xylene cyanol.

Totalt over 100 ml av denaturering lflsning: 95% (w/v) formamide, 0,05% bromphenol blue,

0,05% xylene cyanol i 10 rnM NaOH.

3.5.2

Tilberedning

av prgver til elektroferese

7

p1

av

PCR produkt med standard pippeteres i en ny

«PCR

plastikk brett».

15

ul av DNA denaturering løsning tilsettes. Til slutt tilsettes 15 p1 olje.

Prflvebrettet settes i is til det plasseres i PCR maskinen som er varmet opp til 95°C.

Her blir produktet denaturert v195~~

i nØyaktig 5 minutter. Derte gjØres for

å

skille 2 tråder

DNA streng til enkeltrådet DNA streng.

Når tiden er ute settes prgvebrettet umiddelbart på is.

---

3.5.3

Elektroferese

Elektroforese med 12,5% Exel

-

gel.

Litt dest. vann sprøytes på elektroforeseapperatet før gelen setter på.

Dette gjøres for letter

å

hjelpe gelen på plass i elektroferese instrumentet.

Elektrodene settes riktig på. Viktig

å

få dem ca.

0,50

mm innenfor kanten av gelen.

2 yl kb ladder standard settes på gelen.

22 yl av den nye PCR produktet settes på.

Gelen kjøres i ca. 2 timer

Program:

Volt

Current

Pover

600

5

O

30

202

50

12

576

50

29

Når

gelen er ferdigkjørt legges den forsiktig ned i en plastbakke på et vippebrett for

sølvfarging. (se egen prosedyre for sølvfarging i vedlegg).

Etter sølvfarging settes gelen til tørking.

Dokumentering ved fotografering i uv-lys.

---

3.5.4

Prosedyre for geltørking:

Etter s~lvfarging

legges gelen i et kar med destilert vann. Tas opp og «pakkes» inn i

cellofanpapir. Viktig at alle luftbobler er fjernet. (Luftboblene kan fjernes ved

å

sprute dest.

vann over). En metallramme festes rundt gelen ved hjelp av plastklyper.

Lufttørkes i

3

timer. Dokumentering ved fotografering i uv-lys

---

Resultater

a

Torsk

1

2 3 4

5

6

7 8 9 10 11 1213 14 1516 17181920 21 2223242526272829

Nr

Pave

1

-

3

Iambda DNA standad

4

-

11

Twskemuskel, ubehandlet

12

-

19

Torskelever

20

-

23

Twskemuskel, kokt

24

-

26

Torskernuskel.

stekl

27

-

29

Torskcmuskcl, autoklavert

Nr

Pwve

1

-

3

Lambda DNA

standard

4

-

11

Hyse

muskel,

ubehandlet

12

-

18

Hyselever

19

-

22

Hyse muskel, kokt

23

-

25

Hyse muskel, stekt

26

-

28

Hyse muskel, autoklavert

Figur 5 a,b,c

Agarosegel

elektrofem av ufortynnet DNA ekstrakt av torsk (a), hyse (b) og kolmule (c). Beskrivelse av

hvert

bånd

blir vist i tabell ved siden av hver figur

---

Kb ladder

Torsk

Kolmule

H20

Kb ladder

Muskel

Lever

Muskel Lever Muskel

Figur 6. SSCP analyser kjart på

2,5

%

Excel gel med primer nr. 249 og nr 246.

---

a) TORSK

b) HYSE

C) KOLMULE

Figur 7. a,b,c.

RAPD

analyser på muskel av torsk, hyse og kolmule. Kj~rt

på agarosegel med Primer T-20

---

4

DISKUSJON

Figur 5 a,b og c viser oss mengden DNA i prøven. Sterke bånd Øverst på gelen indikerer at det

er (mye) h~ymolekylrert

DNA i prøven. Svakere bånd viser mindre mengde, mens "skyer"

lenere ned på gelen viser degradert DNA. Det kan virke som om DNA i enkelte prøver er noe

degradert, dvs. at DNA strengen er kuttet opp i mindre bånd. Dette vises i de behandlede

prøvene på grunn av svak dokumentasjon av båndene.

Cytokromct i hver art har forskjellig aminosyrefrekvens og genct som koder for det har

dermed forskjellig DNA sekvens. Det gir hver

art

forskjellig mønster på gelen. Se figur 8.

Prøvene av torsk viser noe svake bånd. De svake båndene skyldes for lite prove av DNA, men

vi kan likevel se at prøvene av torskemuskel og torskelever viser like monster.

Prøvene av torsk viser forskjellig mønster fra hyse og kolmuIe. Hver

art

viser dermed

forskjellig mØns ter.

Noen av båndene i gelen viser tilsynelatende varierende mønster (spesielt hyse-Iever). Dette

skyldes en defekt i strornkilden til elektroferesekammeret, og ikke feil med prøven.

Figur 9 viser fingerprining av artene torsk, hyse og kolmule. Her ser vi at hver art viser

forskjellige mønster, men like mønster innad i hver art. For torsk kan en se at bane nr.6,8 og

9 ikke gir høymolaere bånd. Dette skyldes at DNA i prøven var degradert og dårlig (se fig.

5A).

Ofte er det nukleaser som kutter DNA-strengen i mindre fragmenter og dermed viser

gelen svakere bånd. DNA kan også kuttes med varmebehandling, se kokte og stekte prØver

fig. 5.

Det samme gjelder for hyse og kolmule.

---

5

KONKLUSJON

Hver art, torsk, kolmule og hyse viser identisk mønster, men det er forskjellig mønster

mellom de forskjellige artene.

Dette gjelder for RAPD analyser av torsk, hyse og kolmule

kjørt

på agarosegel med primer

T-20.

Det gjelder også for SSCP analyser kj~rt

på 2,5

%

Exel gel med primer nr. 249 og nr. 246.

---

6

Utstyr og kjernikalieliste

Autoklav, merke:

Thune Maskiner

As,

Hamar, reg.nr.24058

Til DNA ekstraksjon

Eppendorfrbr 2,2 ml

Salt lysis buffer

20

%

SDS, Sigma L- 4390

Protease K,

-

Boehringer Mannheim

6 M NaCl,

-

Sigma S- 3014

Isopropanol,

-

Prima Vinnmolopolet

50 mM Tris-HC1. PH 8,0,

-

Sigma T- 3253

Sentrifuge, Eppendorf Centrifuge 5415 C

Thermocycler (PCR maskin),

-

Farge (loading dye) (som tilsettes etter PCR):

-

Ficoll

-

Pharmacia

-

Bromophenol blue

-

Merck 8122

-

Xylene cyanol

-

Sigma X- 4126

Elektroforeseutstyr til agarosegel:

-

Power supply: Hoefer, San Fransisco PSSOOXT

-

Elektroforesekar: Sceoplas

Elektroforese utstyr til SSCP analyse:

LKR Bromma 21 17 Multiphor Electrophoresis Unit

Bufferstrips: Excel Gel SDS bufferstrips Code No 17-1342-01

Gel: 12.5

%

Excel Gel, A. Pharmacia Biotech

Gelt~rke:

Bio

-

Rad Gel Air Dryer

Cellofan for «innpakning av gelen»: Bio

-

Rad

Cat.

No 1681778

---

Uv

lampe

-

Mighty Bright Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco

«Mikro-titrer brett til PCR maskinen»

COSTAR Thermowell m

65 11 cat.no, Thinn-wall Polycarbonate ,96 Wall Plata

Modell M

Agarose

Nusieve

-

FMC

-

Cat. no. 50085

Seakeni LE

-

FMC

-

Cat.no. 50004

TBE buffer:

-

Tris (hydroxymethyl) aminomethane

-

Merck 1

.O838

-

Boric acid

-

Merck 1 .O0

165

-

EDTA: Triplex

-

Merck 841

8

Larnba standard

-

Gibco Brl Cat.no. 25250-028

Mix.

0,4 y M primer

T-20-

sekvens

-

S'-GACCAATGCC-3'

-

Operon Technologies Inc. Alarneda,

California

Buffer

-

Perkin Elmer/Roche

dNTPs

-

Pharmacia Biotech 27-2035-02

MgC12

-

Yerkin ElmerIRoche

-

E 2059

S

toffel

-

Perkin Eliner/Rochc

DNA

(

1

kb ladder)

-

Gibco BKL Cat.no. 15815-024

---

SøIvfarging.

Referanse: Ansorge

W

(1983). Fast visualization of protein bands by impregnation in

potassium permanganate and silver nitrate. In Electrophoresis'82.Ed. Stathakos D, pp

235-

242. Walter de Gruyter

&

Co. Berlin, New York.

Alle kjernikkaliene er fra Merck og har p.a. kvalitet.

S~lvfarging

Prosedyre:

Tykkelse

0,75 mm

Fiksering

20 minutter

So1.A.

10 min.

KMn04

10 min.

So1.A

10 min.

Ethanol 10

%

10 min.

H20

10 min.

AgNos

10 min.

H20

2 x hurtig

1 min.

frernkaIler

inntil båndene kommer frem

Sol. A

Stopper reaksjonen

---

SØLV

Konsentrasion for 300 ml

CuC12 2H20

2

%

6g

TCA

12

%

36

g

Ethanol

50

%

156

ml

Nok til

2 geler 14 x 16

Konsentrasjon

for 900 ml

Ethanol

10

%

94

ml

Acetic Acid

5

%

45

ml

Nok til

2 geler 14

x

16

Konsentrasion for 300 ml

Ethanol

10

%

21 ml

KMn04

0,01

%

0,02 g

&No3

0,l

%

012 g

K2c03

10 %

m

g,

Nok til

2 geler 14

x

16

Dcveloper: 2% KzC03

+

0,01

%

formaldehyde:

Fonscntrasion

for 400

ml

K2C03

2%

8g

Formaldehyde 0,01

%

108

pl

Nok til

2 geler 14

x

16

---

Kb

-

Fragment no

Fragment no

1

12,216

13

2

11,198

14

3

10,180

15

4

9,162

16

5

8,144

17

6

7,126

18

7

6,108

19

8

5,090

20

9

4,072

21

1

O

3,054

22

11

2,036

23

12

1,636

24

Fragment no 14 og 15, bp 517 og 506 står tett sammen.

Primer

Navn

Primer no For:

Sekvens

Fl3

349 454986

Sppident

5'-GTC-GAA-TGA-ATC-TGA-GAA-GGC-TT-3'

Fl3

346

45987

Sppident

5

'-CCR-ATT-

GGG-TTG-TTT-GAC-CCT-GTT-TC

-3 '

---

Oppskrifter:

1M Tris

30,75

g Tris

+ <

10

ml

6M

HC1 til pH

8,O

til

250

ml med dest vann.

Au toklaveres.

0.5 M

EDTA

-

di Na Salt

VH

8,O.

18,61

g

EDTA

+

2

g NaOH

til

100

ml. med dest.vann.

Autoklaveres.

6 M NaCl

17,53

g NaCl

til

50

ml dest.vann.

Autoklaveres

5

M NaC1

14,61

g NaCl

til

50

ml dest.vann.

Au toklaveres.

20%

SDS

5 g

SDS

til

25

ml. Dest.vann

Ikke autoklaver.

ALT UTSTYR SOM SKAL BRUKES SKAL AUTOKLAVERES FØR BRUK.

VIKTIG

Å

ARBEIDE STERILT OG NØYAKTIG UNDER HELE PROSESSEN.

---

REFERANSER

Aagersborg, A., Dahl, R.,

&

Martinez, I. (1996) Sample prcp:ir:it

ioii

iiiitl

I

)NA

extraction procedures for PCR identification of Lesterin rnonocytogciw

iii sc.;ili~ciil\

Int. J. Food Microbiol. in press.

Martines, I., Dahl, R., (1 996) Fast detcction og Listeria in fish

prodiicls.

2""

International

Birger Jager and Hans-Volker Tichy, Identification of animal species hy

SSC'I'

analysis f amplificd cytochrome b gene fragments.

Hcrluf Thougaard, Verner Varlund, Rene Møller Madsen (1

997), Teoretisk

mikrobiologi for laboratoriefolk

Martinet, I.

&

Dahl, R., (1994a) Fast detection of Listeria monocytogenes in fish

products. Report series: Norvegian Institute of Fisheries and Aquaculture. Report no.

81

1

994

Statens Næringsmiddeltilsyn (1993) Forskrift om merking av næringsmidler. (Kripitcl

11. Generelle krav til merking). Nye forskrifter med EØS. Regelverksamling. Vedtatt

20. of 21. desember 1993. nr. 1385. Oslo. pp:93-104.

Martinez, I.,

&

Brox, V., RAPD fingerprinting av Listeria monocytogenes. Pros-jekt

nr. (NFR): 1218011112

Barlett, S.E

&

Davidson, W.S. (1992) FINS (Forensically informative nucleotide

sequencing): a procedyre for identifying the animal origin of bilogical specimens.

BioTechniques, 12: 408-41

..

Rrock, 1997: Biology of microorganisms

Rhebein, H., Mackie, I. M., Pryde, S., Gonzalez-Sotelo, C., Perez-Martin, R.,

Quintciro, J.

&

Rey-Mende, M. (1995) Fish species identification in canned tuna by

DNA analysis (PCR-SSCP). Ing.Fischwirtsch., 42: 209-212

Jager, Birgit, Ticby Hans-Volker, TOV Energie und Umwelt GmbH, Freiburg,

Germany. Identification of animal species by SSCP analysis of amplificd cytochrome

b gene fragments

Martinez, I. (1993) Species identification of a marine mamma1 musclc. Report Series:

Norwegian Institute ig Fisheries and Aquaculture. Confidential.