Sammenhengen mellom dannelse av AGE og utvikling av alders-assosierte lidelser

Prosjektansvarlig:
Bård Smedsrød
Professor, dr.philos., Avdeling for eksperimentell patologi, IMB, Universitetet i Tromsø, 9037 Tromsø
Telefon: 77644687
E-post: baards@fagmed.uit.no
Prosjektperiode: 01.01.99 – 31.12.04

Prosjektmedarbeidere:
(alle ved Avd. f. eksp. patol.). Lønnet via SAT: Doktorgrads-stipendiat Dmitri Svistounov; lønnet av NFR: Postdoktor Karen Sørensen; lønnet av IKM: doktorgrads-stipendiat Li Ruomei.

Finansiering:
1. Stipendiat-lønn og drift fra SAT/HelseNord (tildelt kr 380 000 fra SAT i 2004). 2. Postdoktor-lønn og drift (NFR).

Bakgrunn/ Problemstillinger:
Den aldersrelaterte substansen AGE (advanced glycation end products) representerer en stor gruppe kjemiske addukter som bindes til og modifiserer mange av kroppens makromolekyler (proteiner og nukleinsyrer), slik at de kjennes igjen av s.k. scavenger-celler, som fjerner AGE-produktene fra sirkulasjonen. I lever utgjør Kupffercellene og leverendotelet organets populasjon av scavenger-celler som renser blodet effektivt for de fleste AGE-modifiserte produkter. Opptaket av AGE-produkter representerer en viktig beskyttelses-funksjon fordi disse produktene kan gi opphav til alvorlige komplikasjoner, f.eks. aterosklerose og nevrotoksisitet dersom de tillates å sirkulere. Prosjektet er fokusert på hvordan celler i lever og øye fjerner AGE-produkter og dermed beskytter sentrale funksjoner i kroppen mot AGEs toksiske effekter. Fjerning av AGE har en ”biologisk pris”: Vi har vist at dersom scavenger-cellene tar opp store mengder AGE, kan det svekke ytterligere opptaks-evne i de samme cellene. Dermed kan AGE-produkter unnslippe opptak, og akkumuleres på steder utenfor leveren der de kan utrette skade. I 2004 har vi fortsatt våre studier av hvordan sentrale celler i lever og øye håndterer makromolekyler modifisert med det alders-assosierte adduktet AGE. De viktigste forskningsresultater i 2004 kan opppsummeres som følger: 1) Leverens sinusoidale endotel (”scavenger-endotelet”) har lavere kapasitet til å bryte ned AGE i eldre dyr sammenlignet med unge (prepubertale) dyr. 2) Størrelsen og relativ molekylvekts-distribusjon av de akkumulerte nedbrytnings-produktene etter opptak av AGE er klart forskjellige i scavenger-celler fra lever hos unge og gamle mus. Dette tolker vi slik at cellenes evne til å kvitte seg med internalisert AGE er basert mer på f.eks. oksidative prosesser enn på aktivitet av lysosomale enzymer. 3) Strukturbestemmelse av AGE-nedbrytningsproduktene vil antakelig være viktig i våre forsøk på å forstå mekanismen bak AGE’s toksiske effekt på celler. En satsning på å bruke massespektrometri (MS) i bestemmelse av molekyl-strukturen til de ulike AGE-nedbrytningsproduktene har hittil slått feil. Siden MS synes å være den eneste metoden som kan gi oss strukturen på disse produktene, vil vi overveie å fortsette langs ”MS-sporet”.

Prosjektets hovedmål:
Ansamling av AGE (advanced glycation end products) kjennetegner aldringsprosessen. Prosjektets hovedmål er å undersøke om det er en sammenheng mellom denne parameter og økt tendens til utvikling av karskader og AMD hos eldre.

Prosjektets delmål:
1. ”Leverprosjektet” (Hovedsakelig SAT-lønnede Svistounov’s prosjekt) Kartlegging av nedbrytning av AGE i leverceller fra yngre og eldre forsøksdyr.
2. ”Retinaprosjektet” (Fredskorps-lønnede Li og NFR-lønnede Sørensen) Kartlegging av effekten av interaksjon mellom AGE og de retinale celletypene CCE og RPE.

Materiale og metode:
Vi benytter en rekke biokjemiske, cellebiologiske og molrekylærbiologiske metoder, hvorav de fleste er vel etablert i vårt laboratorium. Det vil føre altfor langt å beskrive alle disse metodene i detalj her. Alle metoder vi har benyttet i publiserte arbeider, er behørig beskrevet i de respektive publikasjoner. En metode som har viet forholdsvis mye tid under 2004, er massespektrometri i forsøk på å karakterisere den kjemiske strukturen til de akkumulerte nedbrytningsprodukter av AGE. Forøvrig gis følgende grove oversikt over de metoder og det materiale vi benytter (kopiert fra forrige års årsrappport):”Leverprosjektet”: SEC skaffes fra mus, rotte og gris. Vi har utviklet unike metoder for å etablere meget rene primær-kulturer av SEC. All informasjon tyder på at SEC fra disse artene har samme funksjon som SEC fra menneske. AGE skaffes til veie ved en metode utviklet i vårt laboratorium. Vi får også tilsendt AGE fra vår samarbeidsgruppe i Japan. Begge typer AGE er generert in vitro ved å la glukose reagere med serum-albumin. Antistoff mot AGE skaffes fra våre samarbeidspartnere i Japan. Interaksjon mellom AGE og SEC studeres hovedsakelig ved bruk av radioaktivt merket AGE (125I-AGE-albumin). I denne proben er radioisotopen bundet til albumin-delen, mens selve AGE-adduktet ikke kan detekteres. For deteksjon av AGE har vi utviklet en metode for å generere AGE-albumin ved å la 14C-glukose reagere med albumin. Resultatet blir 14C-AGE-albumin av relativt høy spesifikk radioaktivitet. For å studere hva som skjer med AGE-albumin etter at det er tatt opp i SEC, benyttes 1) 125I-AGE-albumin og 14C-AGE-albumin som muliggjør bestemmelse av nedbrytning av hhv. albumin-delen og AGE-delen; 2) subcellulær fraksjonering ved tetthets-sentrifugering (separasjon av de celle-organeller som omsetter AGE-albumin); 3) immun-elektron-mikroskopi for å analysere hvor i cellen AGE og reseptorene for AGE befinner seg. Vi har renset og delvis karakterisert et SEC-reseptor-protein som binder AGE-albumin og bringer det inn i cellen. Antistoff mot dette proteinet brukes nå både i Western blot og immun-histokjemi for å detektere den unike reseptoren på SEC.
“Retinaprosjektet”: Retinaprosjektet er konsentrert om mekanismer for opptak og nedbrytning av negativt ladete avfallsmolekyler (bla AGE-produkter) i retinale pigmentepitelceller (RPE) og sinusoidale endotelceller i den underliggende årehinnen (choriocapillaris endotelceller, CCE). Dyremodeller: Gris og storfe. I tillegg har vi anskaffet en human RPE-cellelinje, ARPE-19.
Fredskorps-stipendiat Li Ruomei (nå lønnet av IKM) har etablert metoder for preparering av RPE-organkulturer fra storfe og gris, og testet opptak av radioaktivt og fluorescensmerkete makromolekyler, inklusive AGE. Metodene her omfatter ulike typer fluorescens-mikroskopi, herunder konfokal-laser-scanning mikroskopi. Immuno-elektron-mikroskopi er også benyttet, og det er gjort opptaks-studier med ligander konjugert direkte til kolloidalt gull (30 nm), hvilket muliggjør direkte studier i transmisjons-elektronmikroskop. Videre har Li etablert primære RPE-cellekulturer fra storfe og gris. Cellene viser hurtig opptak av fluorescensmerkete scavenger-receptor ligander. Det gjenstår å raffinere metodene for kvantitative endocytosestudier. CCE: Vi har etablert metode for isolering og dyrking av bovine CCE celler (eneste lab i verden utenom professor Liu’s lab i Beijing).


Foreløpige resultater:
Håndtering av AGE-produkter i lever. Hovedinnsatsen har - som tidligere - vært konsentrert om fortsatte studier av hvordan celler i lever behandler AGE.
1. Ulik evne til nedbrytning av AGE i lever fra unge og gamle individer. Studier med vår dyremodell (C57BL/6-mus) har vist at leverens evne til å bryte ned AGE-produkter reduseres med økende alder. Denne forandringen inntrer tidlig, allerede ved overgang barn-voksen, og omfatter både leverens totale evne til nedbrytning av AGE-produkter, samt endring i leverens scavenger-celler. Endringen var spesielt tydelig for endotelcellene.
2. Forsøk på karakterisering av nedbrytningsproduktene i leverens scavenger-celler etter opptak av AGE-albumin fra sirkulasjonen. For å kunne rense de ekstraherte AGE-nedbrytningsproduktene, administrerte vi 5 uker før ekstraksjon 14C-AGE-albumin (preparert i vår gruppe) i.v. til mus av ulike aldersgrupper: prepubertale, voksne og middelaldrende (samme aldersgrupper som omtalt i ovenstående avsnitt). På denne måten skaffet vi oss et ”merket spor” som vi kunne følge under renseprosedyrene, for enkelt å kunne monitorere de aktuelle nedbrytningsproduktene. Etter at preparerings-protokollen ble etablert ved å følge isotop-sporet fra 14C-AGE-albumin, ble nøyaktig samme protokoll fulgt for å preparere AGE-nedbrytningsprodukter fra lever i individer som hadde fått administrert umerket AGE-albumin. Alternativt ble lever fra ubehandlete individer av ulike alder prosessert for å undersøke strukturen til nedbrytningsproduktene etter naturlig dannet AGE. Separasjon av AGE-nedbrytningsprodukter etter størrelse ble gjort ved væske-kromatografi, og viste følgende: i) 14C-signalene var betydelig høyere i lever-ekstrakt fra middelaldrende mus enn fra voksne og prepubertale mus. Dette stemmer overens med tidligere funn i vårt laboartorium, der vi viste at AGE-nedbrytningsprodukter forsvinner raskere fra lever i prepubertale enn fra eldre mus. I tillegg til at lever fra yngre mus kvittet seg med AGE-nedbrytningsprodukter raskere enn lever fra eldre mus, viste kromatografi-studiene at det var klare kvalitative forskjeller på de AGE-produktene som ble påvist i levre fra mus av ulik alder. Disse forskjellene vil det føre for langt å beskrive i denne rapporten. Men resultatene gir grunn til å anta at den økte lagringstiden av AGE-nedbrytningsprodukter i eldre mus ikke ene og alene skyldes nedsatt lysosomal enzym-aktivitet. Vi spekulerer nå på om evnen til å kvitte seg raskt med AGE-nedbrytningsprodukter kan tilskrives andre mekanismer enn enzymbaserte aktiviteter – f.eks. oksidative prosesser.
Etter at størrelse-karaktersiseringen av AGE-nedbrytningsproduktene i leverens scavenger-celler var kartlagt, ønsket vi å gå enda et skritt videre, nemlig å struktur-bestemme restproduktene etter AGE-nedbrytning. Dette lar seg kun gjøre ved bruk av massespektrometri (MS), og mye tid har derfor gått med for prosjektets stipendiat Dmitri Svistounov til å etablere metode i samarbeid med en av verdens ledende MS-grupper ved Universitetet i Uppsala. Konklusjonen etter å ha satset mye tid på MS-metodikk var at det var for lite utgangsmateriale til å gi pålitelige fragmenteringsdata. Dette førte til at det hittil har vært umulig å innhente struktur-infomasjon om AGE-nedbrytningsprodukter. Eneste vei å gå for å løse dette problemet vil nå være å legge inn et trinn til med ionebytte-kromatografi. Dette vil bli vurdert videre når Svistounov har gjort ferdig sin doktorgrad.
Håndtering av AGE-produkter i celler som kler Bruchs membran i øye. Aldersrelatert sykdom i retina er korrelert med endringer i Bruchs membran, og inkluderer akkumulering av AGE og andre modifisert makromolekyler. Spesialiserte scavenger-celler er viktige for opptak og nedbrytning av slike molekyler både lokalt og perifert. Vår hypotese er at endotelcellene i de venøse sinusoidene under årehinnen (choroid) like under Bruchs membran (det s.k. choriocapillaris-endotelet, CCE), har en slik lokal scavenger-funksjon i øyet, og at en dysfunksjon av disse cellene kan være medvirkende årsak til utvikling av bl.a. aldersrelatert makuladegenerasjon. Som et viktig steg på veien til å etablere en modell for studier av aldersrelaterte forandringer i retina og choroid har vi i 2004 etablert langtidskulturer av CCE fra storfe og studert endocytose av AGE-albumin i disse cellene. Isotop- og fluorokrom-merket AGE-albumin ble raskt og effektivt tatt opp i cellene. Opptaket var spesifikt og doseavhengig, og kunne delvis blokkeres med antistoff mot Stabilin 2, som er en viktig scavenger-reseptor i sinusoidalt lever-endotel og andre typer scavenger-endotel. Immunmerking og westernblot-analyser bekrefter at cellene uttrykker Stabilin 2. Vår konklusjon så langt er at CCE aktivt endocyterer AGE-albumin og at opptaket delvis skjer via Stabilin 2. Resultatene vil bli presentert på en internasjonal øyekonferanse i Fort Lauderdale, Florida, 1.-5- mai 2005: Annual Meeting of the Association for Research in Vision and Ophtalmolog (ARVO).

Publikasjoner (2003):
McCourt, P.A.G., Hansen, B., Svistuonov, D., Johansson, S., Longati, P., Schledzewski, K., Kzhyshkowska, J., Goerdt, S., Johansson, S., Smedsrød, B. The liver sinusoidal endothelial cell hyaluronan receptor and its homolog, stabilin-1 – Their roles (known and unknown) in endocytosis. Comp. Hepatol. 2004, 3(Suppl 1):S24 (online journal)
Smedsrød, B. Clearance function of scavenger endothelial cells Comp. Hepatol. 2004, 3 (Suppl 1):S22 (online journal) Nedredal, G.I., Elvevold, K.H., Ytrebø, L.M., Olsen, R., Revhaug, A., Smedsrød, B. Liver sinusoidal endothelial cells represent an important blood clearance system in pigs. Compar. Hepatol. 2004, 3(Suppl 1):S22 (online journal)
Elvevold, K.H., Nedredal, G.I., Revhaug, A., Smedsrod, B. Scavenger properties of cultivated pig liver endothelial cells. Compar. Hepatol. 2004, 3:4 (12. Aug) (online journal)
Svistounov, D., Smedsrod, B. Hepatic clearance of advanced glycation end products (AGEs)--myth or truth? J Hepatol. 2004 Dec;41(6):1038-40
Mousavi, S.A., Sato, M., Sporstol, M., Smedsrod, B., Berg, T., Kojima, N., Senoo, H. Uptake of denatured collagen into hepatic stellate cells: Evidence for the involvement of urokinase plasminogen activator associated protein/Endo180.Biochem J. 2004 Oct 27; [Epub ahead of print]
Li, R.M., Sorensen, K.K., Smedsrod, B., Liu, X.P. [Receptor mediated endocytosis of retinal pigment epithelial cell] Zhonghua Yan Ke Za Zhi. 2004 Aug;40(8):539-44. Chinese.

Kurs/Konferanser:
NFR-møte 2.9.04 (Prosjekt-presentasjoner i Aldersforskningsprogrammet; 1 foredrag)12th International Symposium on Cells of the Hepatic Sinusoid (Bilbao, Spania, 5-9.9.04; 4 foredrag og 1 poster)Meda Liver Workshop, Steningevik, Märsta, Sverige 22-23.1.04 (”Mechanisms of liver cell damage”. Lukket, invitert møte av eksperter som diskuterer utvalgte tema vedr. lever). Gordon-confer. ENDOTHELIAL CELL PHENOTYPES IN HEALTH & DISEASE, Proctor Academy 22-27.08.04. Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD), Boston, USA 30.10-2.11.04.Årlig prosjekt-møte mellom partnere i Tromsø, Uppsala og Mannheim (8.-10.10.04 i Mannheim: ”Stabilins” (2 foredrag). Foredrag i forum for aldersforskning i Tromsø 4.5.04: ”Aldringssubstanser svekker leverens blodrensefunksjon” (1 fordrag). Invitert foredrag ved EMBL, Heidelberg, Tyskland: 7.10.04: "Vertebrate scavenger endothelial cells - endocytic extremists fighting circulating waste macromolecules of self and foreign origin" (1 foredrag).

Samarbeidspartnere:
For å sikre en forskning som ligger i fronten både hva gjelder kvantitet og kvalitet, har vi etablert samarbeid med flere grupper utenfor avdelingen. To samarbeidspartnere befinner seg i vårt eget universitets/klinikk-miljø, nemlig Kirurgisk forskingslaboratorium og Øyeavdelinga, mens de øverige 4 samarbeidspartnerne befinner seg i andre land (Sverige [Uppsala], Tyskland [Mannheim], Kina [Beijing], og USA [Tucson]).
1. Kirurgisk forskningslaboratorium, UiTø/UNN (Kontakt: cand. med. Geir Ivar Nedredal) Tilgang til grisemodell for lever og øye.).
2. Øyeavdelinga, UNN (Kontakt: Terje Christoffersen; konkret samarbeidspartner (dorktorgrads-stipendiat): cand. med. Ruomei Li. Tilgang til klinisk ekspertise innen oftalmologi.).
3. Uppsala: Kontakt: Prof. Staffan Johansson. Samarbeidet dreier seg om kloning og ytterligere strukturell karakterisering av den unike scavenger-reseptoren på leverens sinusoidale endotel, som fjerner bl.a. advanced glycation end products (AGEs) fra sirkulasjonen.
4. Mannheim: Kontakt: Prof. Sergei Goerdt. Samarbeidet dreier seg om karakterisering av SEC-scavenger-reseptoren, samt produksjon av knock-out-mus som mangler denne reseptoren.
5. Beijing: Kontakt: prof. Xipu Liu (prof. II ved IKM). Samarbeidet dreier seg om alders-relatert makula-degenerasjon, med spesiell fokus på effekt av AGE på to sentrale celler i retina. Prof. Xipu har etablert en unik tekninkk for å isolere og dyrke en type sinusoidalt endotel fra retina (choriocapillaris-endotel – CCE). Metoden er overført til vårt laboratorium ved at hans student Ruomei Li har flyttet til Tromsø og blitt registrert som doktorgrads-student ved vår avdeling.
6. Tucson, Arizona: Kontakt: Prof. Robert S. McCuskey (prof. II ved IMB). Samarbeidet dreier seg om aldersrelaterte endringer i leverens struktur, mikrosirkulasjon og scavenger-funksjon. I dette samarbeidet utnyttes prof. McCuskey’s mangeårige ekspertise i bruk av s.k. in vivo-mikroskopi. Vi har nylig sendt inn en felles søknad om støtte til dette prosjektet til NIH.