Solveig van Nes disputerte 20. januar 2006

Ane Skjelfjord

Kveite er en ettertraktet matfisk med høy markedsverdi sammenlignet med andre fiskearter. Ettersom hunnene vokser raskere og blir større enn hannene, vil økt andel hunner i produksjonen gi store økonomiske fordeler for kveiteoppdretten. Det er derfor av grunnleggende betydning å undersøke om denne utviklingen er temperaturavhengig, slik at temperaturforholdene kan tilrettelegges for å oppnå størst andel hunner.

Characterisation of the aromatase and estrogen receptor genes in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus): Effects of water temperature on the development of molecular and phenotypic gender

English language abstract
The Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) is one of the most highly priced fish in the market. The reduction in wild populations over the past decades as well as good growth rates in relatively cold water, makes this species ideal for aquaculture at high latitudes. Since the females display faster somatic growth and reach a larger ultimate size than the males, an enhanced female ratio would have obvious economical advantages for halibut production. Water temperature during early developmental stages has been shown to influence the direction of phenotypic gender development. Therefore, a better understanding of processes involved in sexual development and assessing possible thermolability in gonadal differentiation in order to adjust aquaculture conditions to skew the ratio in favor of females is of great importance for improvement of the Atlantic halibut industry.

P450aromatase (CYP19) is an essential part of the enzyme complex catalysing the conversion of androgens into estrogens, which is a key reaction during gonadal development in all vertebrates. We cloned two genetic distinct forms of CYP19, and by the use of RT-PCR found a sexual dimorphic expression pattern of the gene encoding the so-called ovary-type aromatase (cyp19a) was found in the gonads, whereas the brain-type (cyp19b) mRNA was ubiquitously expressed in tissues of adult males and females. Low sequence similarity together with the differential expression pattern of the two cyp19 genes, strongly indicate that the genes are differently regulated and that the encoding isozymes have adopted distinct functional roles in Atlantic halibut (Paper I).

To better understand the role of both CYP19 isozymes during sexual differentiation in Atlantic halibut, we performed real-time RT-PCR to quantify their mRNA levels in ovary and brain during gonadal development. Both enzymes showed high levels of expression prior to any histologically detectable ovarian differentiation, with increased expression in brain occuring slightly earlier than in the gonadal area. This suggests that sexual differentiation in Atlantic halibut may begin in the brain prior to gonadal differentiation, supporting the hypothesis that steroid hormone expression in the brain also plays an important part in phenotypic sex differentiation in fish (Paper II).

Since ovarian development in lower vertebrates is mainly controlled by estrogen-producing (aromatase) and estrogen-signalling (estrogen receptor [esr]) pathways, which seem to be thermolabile, we conducted an experiment to examine the effect of temperature on phenotypic gender development as well as the transcription rates of the cyp19 and esr genes in Atlantic halibut using real-time RT-PCR. The proportion of females never exceeded 50%, supporting the idea that the homogametic (XX) female gender is the most labile. Thus, the thermolability of sex differentiation in Atlantic halibut can probably not lead to production of monosex populations. However, the results indicate the importance of adjusting temperatures in aquaculture to skew the sex ratios in the direction of females as opposed to the possible male favouring conditions used in farming at present. In addition we found a positive correlation between the transcription level of cyp19a and ovarian phenotype, as the gene expression increased with increasing female incidence in the lowest temperature group. In contrast to cyp19a, cyp19b, esr1 and esr2 showed no temperature-related expression pattern (Paper III).

By means of in situ hybridization (ISH) we localized cyp19a transcripts in the midbrain of premetamorphosed larvae, and in the undifferentiated gonad of larvae at the end of metamorphosis. In the premature ovary of juveniles, cyp19a mRNA was localized in the thecal cells of previtellogenic oocytes (Paper IV), while the absence of cyp19a transcripts in testits was demonstrated by RT-PCR (Paper I). Altogether these findings support our suggestion that cyp19a is a strong candidate gene for ovarian sex differentiation in Atlantic halibut. However should be taken in concluding its role in the determination process as it cannot be ascertained whether it is a product of or a cause for sex determination.

Key words / ISI database key words: sexual differentiation; gonadal differentiation; Atlantic halibut; Hippoglossus hippoglossus, aromatase; cyp19; cyp19a; cyp19b; teleost; phylogeny; cdna cloning; cytochrome-p450; estrogen-receptors; estrogen, tissue-specific gene expression; aquaculture, sex-reversal, sex-ratio, neo-male, temperature,

Address as from February 2006:
AKVAFORSK, P.O.Box 5010, N-1432 Ås



Karakterisering av aromatase- og østrogen-reseptor genene i kveite (Hippoglossus hippoglossus): Effekt av vanntemperatur på molekylær og fenotypisk kjønnsutvikling

Norsk sammendrag
Kveite (Hippoglossus hippoglossus) er en ettertraktet matfisk med høy markedsverdi sammenlignet med andre fiskearter. Nedgang i naturlige populasjoner over de siste tiår, samt god tilvekst i relativt kalde vanntemperaturer, gjør denne arten ideell for oppdrett på de nordlige breddegrader. Ettersom hunnene vokser raskere og blir større enn hannene, vil økt andel hunner i produksjonen gi store økonomiske fordeler for kveiteoppdretten. Vanntemperaturen har vist seg å være avgjørende for hvilket fenotypisk kjønn individer utvikler i flere aktuelle oppdrettsarter. Det er derfor av grunnleggende betydning for optimalisering av kveiteoppdretten å undersøke om denne utviklingen er termolabil slik at temperaturforholdene kan tilrettelegges for å oppnå størst andel hunner.

P450aromatase (CYP19) utgjør en viktig del av enzymkomplekset som katalyserer omsetningen av androgener til østrogener, som er en nøkkelreaksjon i kjønnsutviklingen hos alle vertebrater. Vi klonet to genetisk distinkte former av CYP19. Ved hjelp av RT-PCR påviste vi et kjønnsspesifikt ekspresjonsmønster for den såkalte ovarievarianten (cyp19a) i gonade, mens hjernevarianten (cyp19b) derimot var uttrykt i mange organer og viste ingen kjønnsspesifisitet. Sekvensulikhet samt forskjellige ekspresjonsmønster, indikerer at de to cyp19 genene er ulikt regulert og at de to CYP19 isozymene utøver distinkte funksjoner i kveite (Paper I).

For å øke vår forståelse av rollen til de to CYP19 isozymene under kjønnsdifferensieringen i kveite, utførte vi real-time RT-PCR for å kvantifisere mRNA nivåene i ovarie- og hjerne-området under kjønnsutviklingen. Begge enzymene viste høyt genuttrykk før den histologisk synlige kjønnsdifferensieringen var påbegynt. Transkripsjonsnivået i hjernen økte på et tidligere tidspunkt enn i gonadeanlegget. Dette indikerer at kjønnsdifferensiering initieres i hjernen hos fisk, og at ekspresjonen av steroidhormoner i hjernen dermed også spiller en viktig rolle i utviklingen av det fenotypiske kjønnet (Paper II).

Ettersom ovarieutvikling i lavere vertebrater hovedsakelig reguleres av den temperatursensitive østrogen-produksjonen via CYP19 og østrogensignaloverføring via østrogen reseptor (ESR), utførte vi et eksperiment for å undersøke hvordan vanntemperatur påvirket utvikling av fenotypisk kjønn samt ekspresjonen av cyp19 og esr i larver ved hjelp av real-time RT-PCR (Paper III). Andelen fenotypiske hunner oversteg ikke 50% i noen av behandlingene. Dette støtter antagelsen at det er det homogametiske (XX) hunnkjønnet som viser størst labilitet. Termolabiliteten i kveitas kjønnsutvikling kan derfor ikke brukes til å produsere all-female populasjoner. Resultatene indikerer likevel betydningen av å benytte de temperaturer i oppdrett som gir høyest mulig andel hunnfisk, i motsetning til dagens praksis, som synes å favorisere utvikling av fenotypiske hanner. Videre påviste vi en positiv korrelasjon mellom ekspresjonen av cyp19a og fenotypisk ovarieutvikling, da økning i genekspresjonen var i samsvar med økning i antall hunner i den kaldeste temperaturbehandlingen. I motsetning til cyp19a, viste verken cyp19b, esr1 eller esr2 temperaturrelaterte ekspresjonsmønstre.

Ved hjelp av in situ hybridisering (ISH) lokaliserte vi cyp19a-mRNA i midthjerne hos larver på tidlig metamorfosestadie, samt i gonadeanlegget hos larver på slutten av metamorfosestadiet. I umoden ovarie påviste vi sterkt uttrykk av cyp19a i follikelcellenes thecalag i previtellogene oocytter (Paper IV). Ettersom vi ved hjelp av RT-PCR ikke fant uttrykk av cyp19a i testis (Paper I), underbygger dette våre antagelser om cyp19a som en sterk kandidat i ovariedifferensieringen i kveite. Man kan imidlertid ikke tilskrive genet alene den avgjørende rollen i selve kjønnsdetermineringen, da endringer i ekspresjonsnivå kan være både årsaken til og følgen av determineringen.

Nøkkelord til artikkelsøk: fisk, gen, akvakultur, seksuell differensiering; kjønnsdifferensiering, kveite; Hippoglossus hippoglossus, aromatase; østrogen; cyp19; cyp19a; cyp19b; teleost; fylogeni; flyndrefisk, cytokrom p450, østrogenreseptor; vevs-spesifikk genekspresjon; neo-male, kjønnsreversering, temperatur, kjønnsratio

Adresse pr. februar 2006:
AKVAFORSK, Postboks 5010, 1432 Ås




Oppdatert: 21.09.06
Utskriftsvennlig versjon : Arkiv : Tips en venn