Trine Ytrestøyl

Ane Skjelfjord

Flesh colour in fish has been shown to be an important quality criteria for consumers. The pink flesh colour unique to salmonid fishes is caused by deposition of carotenoids in the muscle. In this thesis, some factors affecting this pigmentation are discussed.

Factors affecting utilisation of carotenoids in salmonid fishes

English language abstract
This thesis focuses on factors that influence the bioavailability of carotenoids primarily in salmonid fishes. Atlantic cod (Gadus morhua) was used in one experiment to study uptake in a white-fleshed species. Absorption from the intestine is a major limitation for the utilisation of carotenoids, and factors that influence gut absorption can potentially have a large effect on the amount of carotenoid retained in the body. The apparent digestibility (ADC) of astaxanthin (3,3´-dihydroxy-ß,ß-carotene-4,4´-dione) in Atlantic salmon (Salmo salar) was affected both by water temperature and by ration level (Papers I and II). By decreasing the water temperature from 12 to 8 °C the apparent digestibility of astaxanthin was reduced from 45 to 40 % (Paper I). The apparent digestibility of astaxanthin decreased with increasing feed intake in a linear fashion when the daily ration level ranged from 0.15-0.63 % of biomass for groups of Atlantic salmon (Paper II). The corresponding ADC ranged from 60 to 26 %. A positive linear correlation was observed between digested astaxanthin and ration level. However, the ratio of mg digested astaxanthin/growth rate (TGC) decreased with increasing feed intake. Thus, a reduced muscle concentration of astaxanthin may be caused by a high feed intake. There was, however, no significant correlation between the individual meal sizes measured by radiographic methods and astaxanthin ADC although a weak trend was observed in one of the treatments (p=0.07, R²=0.22) (Paper I).

The plasma content of idoxanthin (3,3´,4´-trihydroxy-ß,ß-carotene-4-one), a reductive metabolite of astaxanthin, was used as an indicator of metabolic turnover. The concentration of idoxanthin in plasma of individual fish ranged from less than 0.5 to 70 % of total carotenoids and was not affected by temperature or feed intake (Paper I). However, the plasma concentration of carotenoids was positively correlated with feed intake both in individual fish and at the group level. Fish without faeces in the hindgut had a lower plasma carotenoid concentration than fish with faeces in the hindgut (Papers I and II). Thus, if plasma carotenoid concentrations are used as an indictor of bioavailability it is important that the feed intake is monitored carefully.

4´-Hydroxyechinenone (4´-hydroxy-ß,ß-carotene-4-one), a reductive metabolite of canthaxanthin, was isolated from muscle from Atlantic salmon fed a diet supplemented with canthaxanthin and characterised by mass spectrometry, absorption maximum and co-chromatography with authentic standard (paper III). The stereoselective reduction of canthaxanthin in favour of the (4´S)-isomer (comprising ca. 81 % of the total 4´-hydroxyechinenone) strongly indicates that it was a metabolic product of canthaxanthin.

The accumulation of carotenoids and lipid in muscle was studied in Atlantic salmon transferred to seawater as 0+ or 1+ smolts (paper III). The fish were fed a diet containing a mixture of canthaxanthin (30 mg kg^-l) and astaxanthin (30 mg kg^-1). The 0+ smolts had a higher muscle carotenoid content compared to 1+ smolts when the difference in body weight was corrected for. The higher carotenoid content in 0+ smolts was also reflected by a higher colourimetrically recorded redness (a*-value) and yellowness (b*-values) and lower lightness (L*) in 0+ than in 1+ smolts of a similar size. The content of 4´-hydroxyechinenone in the muscle was low (< 3.1 % of total carotenoids) and declined with increasing fish size in both smolt types. The colour characteristics of the muscle (measured as a* and b*-values) mainly depended on the carotenoid concentration of the muscle and were only marginally affected by smolt production regime. Salmon transferred to seawater as 0+ smolts deposited carotenoids more efficiently than 1+ smolts during the summer and early fall. The higher muscle concentration in 0+ smolts during this period indicates that the deposition of carotenoids did not depend on the carotenoid level in the muscle. The condition factor was slightly higher in 0+ than in 1+ smolts but there were no differences in muscle lipid content when mass was used as a covariate to correct for the larger size of the 0+ smolts. Thus the results from this study show that the timing of smoltification may influence accumulation of carotenoids and body shape in Atlantic salmon.

When astaxanthin was injected into the abdominal cavity of Atlantic salmon, Atlantic cod and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) the astaxanthin concentrations in plasma and muscle increased in a dose dependent manner in all three species (Papers IV and V). The shape of the dose-response curves was species specific. In salmon and cod (Paper V) the plasma astaxanthin concentrations were much higher than concentrations reported after oral administration of astaxanthin (up to 90 and 43 mg l^-1 in individual fish respectively). Furthermore, there was no indication of a saturation of the blood transport capacity because the dose-response curves in plasma were close to linear in both salmon and cod. In contrast, curvilinear dose-response curves with a relatively lower plasma and muscle response at higher doses injected were observed in both plasma and muscle of rainbow trout (Paper IV). As a result, the mean plasma and muscle concentrations of astaxanthin were higher in salmon (53 mg l^-1 and 18 mg kg^-1 respectively) than in rainbow trout (13 mg l^-1 and 11 mg kg^-1 respectively). The lowest muscle concentrations were found in cod (l mg kg^-1) even though the mean plasma astaxanthin concentration was as high as 36 mg l^-1 in cod injected with 50 mg astaxanthin. However, the cod deposited more astaxanthin in the skin compared to Atlantic salmon and rainbow trout. The observed species specific in vivo distribution of astaxanthin after intraperitoneal administration indicates that the uptake of astaxanthin is regulated at the cellular level in the various tissues.

In conclusion, the results from this thesis may explain the reduced flesh pigmentation that has been reported after periods with rapid growth. It is also shown that the timing of seawater transfer can influence flesh pigmentation and other quality traits in Atlantic salmon. Finally, it is shown that neither the plasma transport capacity nor the muscle binding capacity seems to be limiting factors for flesh pigmentation of Atlantic salmon. Future work should focus on identifying the uptake mechanisms in muscle and other organs involved in carotenoid utilisation.

Key words: Atlantic salmon, astaxanthin, canthaxanthin, metabolism, digestibility, feed intake, temperature, bioavailability, intraperitoneal administration; fish, colour
ISI database key words: trout oncorhynchus-mykiss; salvelinus-alpinus l.; rainbow-trout; arctic charr; proximate composition; product quality; astaxanthin; canthaxanthin; flesh; pigmentation; charr salvelinus-alpinus; dietary astaxanthin; apparent digestibility; quantitative changes; water temperature; body-weight; growth-rate

Pr. august 2006:
Trine Ytrestøyl
AKVAFORSK, NO-6600 Sunndalsøra, NORWAY


Faktorer som påvirker utnyttelse av karotenoider i laksefisk

Norsk sammendrag fra avhandlingen

Denne avhandlingen fokuserer på faktorer som har betydning for biotilgjengeligheten av carotenoider primært i laksefisk. Atlantisk torsk (Gadus morhua) ble brukt i ett eksperiment for å studere opptak i en art som deponerer lite carotenoider i muskel. Absorpsjon fra tarmen er en viktig begrensende faktor for utnyttelse av carotenoider og faktorer som kan påvirke opptak i tarm kan potensielt ha stor betydning for retensjon av carotenoider. Tilsynelatende fordøyelighet (ADC) av astaxanthin (3,3´-dihydroxy-ß,ß-caroten-4,4´-dion) hos atlantisk laks (Salmo salar) ble påvirket av både temperatur og utfôringsnivå (artikkel I og II). Fordøyeligheten av astaxanthin ble redusert fra 45 til 40 % når temperaturen ble senket fra 12 til 8°C. Fordøyeligheten av astaxanthin avtok lineært med økende fôrinntak i grupper av atlantisk laks for fôrrasjoner mellom 0.15-0.63 % av kroppsvekt per dag (artikkel II). Fordøyeligheten av astaxanthin varierte fra 60-26 %. Det var en positiv lineær korrelasjon mellom mengden fordøyd pigment og fôrrasjon. Forholdet mellom antall mg fordøyd astaxanthin og vekstrate (TGC) avtok imidlertid med økende fôrinntak noe som kan resultere i en lavere muskelkonsentrasjon av astaxanthin ved høyere fôrinntak. Det var imidlertid ingen signifikant korrelasjon mellom størrelsen på et enkelt måltid målt ved hjelp av radiografiske metoder i enkeltindivider og fordøyelighet av astaxanthin selv om det ble observert en svak trend i en av behandlingene (p=0.07, R²=0.22) (artikkel I).

Plasmanivået av idoxanthin (3,3´,4´-trihydroxy-ß,ß-caroten-4-on), en reduktiv metabolitt av astaxanthin, ble brukt som et mål på metabolsk omdanning. Konsentrasjonen av idoxanthin i plasma hos enkeltindivider varierte fra under 0.5-70 % av totalt carotenoid og ble ikke påvirket av hverken temperatur eller fôrinntak (artikkel I). Det var en positiv korrelasjon mellom plasmakonsentrasjonen av carotenoider og fôrinntak, både i enkeltfisk og på gruppenivå. Fisk som ikke hadde gjødsel i baktarmen hadde lavere konsentrasjon av carotenoider i plasma enn fisk som hadde gjødsel i baktarmen (artikkel I og II). Det er derfor viktig at fôrinntaket er kjent dersom carotenoidkonsentrasjonen i plasma benyttes som en indikator på biotilgjengelighet.

En reduktiv metabolitt av canthaxanthin, 4´-hydroxyechinenon (4´-hydroxy-ß,ß-caroten-4-­on), ble isolert fra muskel av atlantisk laks som var foret med en diett tilsatt canthaxanthin. Denne metabolitten ble karakterisert ved hjelp av massespektrometri, absorpsjonsmaksimum og ko-kromatografi med autentisk standard (artikkel III). Reaksjonen var stereoselektiv til fordel for (4´S)-isomeren (utgjorde 81 % av total mengde 4´-hydroxyechinenon) noe som tyder på at det var et metabolsk produkt av canthaxanthin.

Deponering av carotenoider og lipid i muskel ble studert i atlantisk laks som var satt i sjø som 0+ eller som 1+ smolt og fôret en diett tilsatt en blanding av canthaxanthin (30 mg kg^-l) og astaxanthin (30 mg kg^-l) (artikkel III). Laks satt i sjø som 0+ smolt hadde et høyere innhold av carotenoider i muskel enn laks satt ut som I + smolt etter at det var korrigert for vektforskjeller. Det høyere innholdet av carotenoider resulterte i høyere verdier for rød (a*­verdier) og gul (b*-verdier) farge og lavere lyshet (L *-verdi) i 0+ sammenlignet med l + smolt av tilsvarende størrelse. Innholdet av 4´-hydroxyechinenon i muskel var forholdsvis lavt (< 3.1 % av totalt carotenoid) og avtok med økende fiskestørreise. Den visuelle fargen på muskelen (målt i form av a* og b*-verdier) var hovedsaklig avhengig av carotenoidkonsentrasjonen i muskel og var bare i liten grad påvirket av betingelsene for smoltproduksjon. Deponering av carotenoider var ikke avhengig av konsentrasjonen av carotenoider i muskel. Laks satt i sjø som 0+ smolt hadde høyere muskelkonsentrasjon og akkumulerte samtidig carotenoider mer effektivt enn I + smolt i løpet av sommeren og tidlig høst. Kondisjonsfaktoren var litt høyere hos 0+ smolt sammenlignet med 1+ men det var ingen forskjeller i fettinnhold i muskel når vekt ble brukt som kovariat for å korrigere for forskjeller i størrelse. Resultatene fra dette forsøket viser at tidspunktet for smoltifisering kan ha betydning for akkumulering av karotenoider og kroppsform i Atlantisk laks.

Det store tapet av carotenoider i gjødsel kan indikere at biotilgjengeligheten av carotenoider vil øke dersom man omgår tarmen ved å injisere carotenoider direkte i bukhulen. Når denne nye teknikken for administrering av astaxanthin ble undersøkt for atlantisk laks, torsk og regnbueørret (Oncorhynchus mykiss) fikk man en dose-avhengig økning i astaxanthinnivåene i plasma og muskel i alle tre arter (artikkel IV og V). Formen på dose-respons kurvene varierte imidlertid for de ulike artene. I laks og torsk (artikkel V) var plasmakonsentrasjonene av astaxanthin mye høyere enn det som er funnet etter oral administrering av astaxanthin (henholdsvis inntil 90 og 43 mg l^-l i enkeltindivider). Det var heller ingen indikasjoner på en metning av transportkapasiteten i blod ettersom dose-respons kurvene for plasma var tilnærmet lineære for både laks og torsk. I regnbueørret ble det imidlertid observert kurvelineære dose-respons sammenhenger for både plasma og muskel hvor den relative responsen avtok med økende dose som ble injisert (artikkel IV). Som følge av dette hadde laksen en høyere gjennomsnittlig konsentrasjon av astaxanthin både i plasma og i muskel (henholdsvis 53 mg l^-l og 18 mg kg^-l) sammenlignet med regnbueørret (henholdsvis 13 mg l^-l og 11 mg kg^-l). De laveste muskelkonsentrasjonene av astaxanthin ble funnet i torsk (1 mg kg^-l) til tross for at plasmakonsentrasjonen i gjennomsnitt var 36 mg l^-l i torsk injisert med 50 mg astaxanthin. Torsken akkumulerte imidlertid mer astaxanthin i skinnet sammenlignet med Atlantisk laks og regnbueørret. Den arts spesifikke distribusjonen av astaxanthin in vivo etter intraperitoneal distribuering indikerer at opptaket av astaxanthin reguleres på cellenivå i de ulike vev.

Oppsummert kan resultatene fra denne avhandlingen forklare reduksjonen i muskel pigmentering som har vært observert i perioder med rask vekst. Det er også vist at tidspunktet for sjøutsetting av smolt kan påvirke muskelpigmentering og andre kvalitetsparametre i atlantisk laks. Til slutt er det vist at verken transportkapasiteten i plasma eller bindingskapasiteten i muskel synes å være begrensende faktorer med hensyn på muskelpigmentering i atlantisk laks. Ny forskning bør fokusere på å identifisere mekanismene for opptak av carotenoider i muskel og andre organer av betydning for utnyttelse av carotenoider.

Nøkkelord til artikkelsøk: Atlantisk laks, astaxanthin, canthaxanthin, metabolisme, fordøyelighet, fôrinntak, temperatur, biotilgjengelighet, intraperitoneal administrering; fisk, farge

Pr. august 2006:
Trine Ytrestøyl
AKVAFORSK, NO-6600 Sunndalsøra, NORWAY



Oppdatert: 11.09.06
Utskriftsvennlig versjon : Arkiv : Tips en venn